Metody Biofizyki Molekularnej_Krystalografia białek(2).pdf

(358 KB) Pobierz
Strukturę przestrzenną białek złożonych maksymalnie z ok. 370 aminokwasów możemy uzyskać
dzięki badaniom NMR. W przypadku większych białek stosuje się metody krystalograficzne.
Odległości między obiektami i ich wielkości nie mogą być wyznaczane z rozdzielczością większą niż
długość fali promieniowania za pomocą której oświetlamy układ. Aby uzyskać dane z rozdzielczością
atomową potrzebne jest promieniowanie o odpowiednio krótkiej długości fali. Dlatego do określania
struktury makromolekuł stosujemy promieniowanie rentgenowskie.
Spis treści
1 Historia
2 Etapy uzyskiwania struktury białka
3 Czynniki wpływające na krystalizacje białek
3.1 Diagram fazowy
3.2 Jak w sposób kontrolowany przenieść białko do strefy przesycenia?
3.3 Odparowywanie wody
3.4 Optymalizacja środowiska krystalizacji
3.5 Inne czynniki, które wpływają na wzrost kryształów białkowych
4 Techniki uzyskiwania kryształów białek
5 Kryształy białkowe
6 Fale
6.1 Prawo Braggów
6.2 Transformata Fouriera
6.3 Splot funkcji
6.4 Ważne zależności
6.5 Dyfrakcja
6.5.1 Obraz dyfrakcyjny
7 W jaki sposób informacja o strukturze obiektu zakodowana jest w jego obrazie dyfrakcyjnym?
7.1 Dyfrakcja na układzie szczelin
7.1.1 Wnioski dla dwuwymiarowego układu szczelin przenoszą się na
trójwymiarowy
7.2 Dyfrakcja w sieci przestrzennej kryształu
7.2.1 Płaszczyzny
7.2.1.1 Okrąg (sfera) Ewalda
7.2.1.2 Rozpraszanie na kryształach to rozpraszanie.
7.2.1.3 Fala ugięta przez ciągły rozkład elektronów
8 Sposoby rozwiązywania problemu fazowego:
8.1 Funkcja Pattersona
8.2 Metoda wielokrotnego podstawienia izomorficznego
8.3 Rozpraszanie anomalne
8.4 Metoda podstawienia molekularnego
8.5 Udokładnianie struktury
9 Zbieranie danych dyfrakcyjnych
9.1 Najczęściej stosowane metody
9.2 Źródła promieniowania
Historia
W 1840 roku F.L. Hunefeld opisał przypadkowo powstałe kryształy hemoglobiny dżdżownicy.
W 1912 roku Max von Laue przeprowadził pierwsze doświadczenie ugięcia promieniowania
rentgenowskiego na krysztale. *Rok później William Henry Bragg i jego syn William Lawrence
Bragg rozwiązali struktury kilku minerałów.
W 1934 roku Arthur Lindo Patterson wyprowadził nazwaną od jego nazwiska funkcję
Pattersona, która umożliwia rozwiązanie problemu fazowego dla struktur zawierających atom
ciężkiego pierwiastka.
Na początku lat 30. XX wieku pojawiły się pierwsze zdjęcia dyfrakcji: na włóknach białek w
laboratorium Williama Astbury'ego i na monokryształach w laboratorium Desmonda Bernala.
W 1951 roku Linus Pauling na podstawie obserwacji krystalograficznych i właściwości wiązań
chemicznych zapostulował struktury alfa-helisy i beta-kartki, jako główne motywy w białkach
(Nagroda Nobla 1954).
Pod koniec lat 50. XX wieku John Kendrew opublikował pierwszą w dziejach strukturę białka,
mioglobiny wieloryba. *W tym samym czasie Max Perutz opublikował strukturę hemoglobiny.
W 1953 roku Rosalind Franklin zarejestrowała zdjęcia rentgenowskie włókien DNA.
W 1965 roku uzyskano pierwszą strukturę lizozymu z białka jaja kurzego. W 1971 roku
utworzono Bank Struktur Białkowych (Protein Data Bank, PDB), w którym zdeponowano 7
struktur białek. W roku 1973 w PDB było zdeponowanych 9 struktur białkowych.
Powolny początkowo rozwój rentgenografii białek wynikał z braku silnych źródeł
promieniowania rentgenowskiego. W latach 70-tych nastąpił skok jakościowy związany z
zastosowaniem synchrotronów jako źródeł promieniowania rentgenowskiego, wprowadzeniem
programowalnych maszyn cyfrowych, oraz rozwojem inżynierii genetycznej i biotechnologii.
Etapy uzyskiwania struktury białka
Do etapów uzyskiwania białka odpowiedniego do badań krystalograficznych, a następnie określania
struktury krystalograficznej należą:
1.
2.
3.
4.
5.
Oczyszczanie.
Krystalizacja (uzyskanie dobrze rozpraszającego monokryształu).
Wstępna analiza dyfrakcyjna (grupa przestrzenna, zdolność rozdzielcza, stabilność w wiązce).
Zebranie pełnych danych dyfrakcyjnych
Rozwiązanie problemu fazowego odpowiednią metodą:
1. Podstawienia molekularnego
2. Anomalnego rozpraszania
3. Podstawienia izomorficznego pochodnych z ciężkimi atomami
6. Utworzenie mapy gęstości elektronowej
7. Interpretacja mapy, udokładnienie struktury
8. Prezentacja graficzna uzyskanej struktury białka
Czynniki wpływające na krystalizacje białek
Diagram fazowy
Na rozpuszczalność białek wpływają „czynniki wytrącające” (precypitanty): np.: sole, glikol
polietylenowy. Diagram fazowy zależności stężenia białka od stężenia precypitanta jest
przedstawiony na Rys. Figure
1.
Diagram fazowy dla hipotetycznego białka w funkcji
stężenia precypitanta.
(i)Dla wysokich stężeń białka i precypitanta białko wytrąca
się w postaci amorficznych agregatów.
(ii)Dla niższych stężeń mogą tworzyć się jądra krystalizacji,
a następnie rozpraszające kryształy.
(iii)Dla jeszcze niższych stężeń, w strefie metastabilnej, nie
tworzą się jądra krystalizacji, ale umieszczenie kryształu
białka w takim roztworze powoduje jego wzrost.
(iv)Dla najniższych stężeń białka są całkowicie
rozpuszczalne.
Jak w sposób kontrolowany przenieść białko do strefy przesycenia?
Dodać precypitant.
Suszyć kroplę cieczy zawierającej białko.
Wymieniać bufor (dializa).
Czekać i regularnie obserwować eksperyment pod mikroskopem.
Odparowywanie wody
Rozpuszczone białko umieszcza się w kropli (~5 ml) ponad lub obok rezerwuaru z buforem
zawierającym większe stężenie czynnika wytrącającego. Kropla i rezerwuar ulegają równoważeniu
wymieniając wodę. Osiągany zostaje stan przesycenia, tworzone są zarodzie krystalizacji i następuje
wzrost kryształów.
Skład roztworu do krystalizacji
(sól, bufor, precypitant) wpływa na rozpuszczalność białek.
Ze zmiana pH niektóre aminokwasy (np. Asp, Glu, Lys, His, Arg, Try) zmieniają stan
naładowania (z obojętnego na naładowany lub odwrotnie).
Zawartość soli wpływa na ładunek powierzchniowy białka i oddziaływania z cząsteczkami
wody. Wsalanie ( dodanie soli zwiększa rozpuszczalność białek) lub wysalanie (dodawanie soli
zmniejsza rozpuszczalność białek)
Rozpuszczalniki polarne np. Glikol polietylenowy (PEG) wiąże cząsteczki wody.
Optymalizacja środowiska krystalizacji
Zakres krystalizacji białek to przedział 2 – 50 mg/ml .
Przeprowadzenie testu PCT (Pre-crystallization test, Hampton Research) — pozwala na
ustalenie granic stężenie białka zdolnego do krystalizacji pomiędzy precypitatem a przejrzysta
kroplą.
Temperatura i jej fluktuacje: białka zwykle krystalizują w zakresie temperatur 4 – 45°C, ale
zdarzają się wyjątki np. glukagon (60°C). Najczęściej dwie równoległe hodowle w
temperaturach 4°C i 20°C.
Pożądana czystość (homogeniczność białka — chemiczna, izomeryczna, konformacyjna,
oligomeryczna) testowana z wykorzystaniem m.in. elektroforezy natywnej (obserwuje się
korelację pomiędzy heterogenicznością oligomeryczną białka a jego zdolnością do
krystalizacji).
Inne czynniki, które wpływają na wzrost kryształów białkowych
Dodatki — jony metali, ligandy,
organizm, z którego wyizolowano białko,
grawitacja, konwekcja, sedymentacja,
drgania, dźwięki,
objętość próbki,
ciśnienie,
proteoliza,
lepkość roztworu,
zanieczyszczenia,
pole elektryczne i magnetyczne itp…
Należy szukać wielu możliwych warunków krystalizacji (w niektórych uzyskuje się małe kryształy, o
kształcie igły, słabo rozpraszające promieniowanie rentgenowskie).
Jeśli nie uzyskamy w pierwszym podejściu kryształów odpowiednich do badań dyfrakcyjnych to
należy zanotować obserwowane typy wytrąceń. Mogą to być wytrącenia amorficzne, nieamorficzne
lub mikrokryształy. Doświadczony „badacz” może na podstawie typu wytrącenia zaplanować dalsze
etapy postępowania w celu uzyskania kryształu.
Techniki uzyskiwania kryształów białek
1. Metoda wiszącej kropli.
Najbardziej rozpowszechniona technika.
Białko z roztworem zawierającym precypitant jest mieszane w stosunku 1:1.
2.
3.
4.
5.
6.
Kropla umieszczana jest na silikonowanej płytce, którą zawiesza się nad zbiornikiem z
roztworem.
Woda paruje z kropli do wyrównania stężeń precypitanta pomiędzy zbiornikiem a kroplą
zawierającą białko.
Zwiększanie stężenia białka i precypitanta powoduje wzrost kryształów.
Metoda siedzącej kropli.
Technika podobna do „wiszącej kropli”.
Kropla umieszczana jest na silikonowanej płytce, którą umieszcza się na podstawce w
zbiorniku z roztworem.
Dializa.
Roztwór białka jest oddzielony od roztworu zewnętrznego za pomocą półprzepuszczalnej
membrany.
Wyrównywanie stężeń precypitanta pomiędzy rozdzielonymi membraną częściami
naczynia powoduje wzrost kryształów.
Batch crystallization.
Krystalizator jest wypełniany roztworem nienasyconym.
Przesycenie jest osiągane przez stopniowe ochładzanie roztworu.
Kryształy o określonym rozkładzie rozmiarów uzyskuje się dzięki określonemu
przebiegowi procesu zmiany temperatury w funkcji czasu.
Mikroposiew.
Pobranie kryształu z kropli.
Mycie kryształu.
Posiew w zrównoważonej kropli będącej w fazie metastabilnej.
Metoda stosowana dla białek, które krystalizują łatwo, ale mają tendencję do tworzenia
małych kryształów.
Makroposiew.
Technika podobna do mikroposiewu.
Różnica — kryształ nie nadający się do badań dyfrakcyjnych jest kruszony.
Następnie pobierane są jego fragmenty i umieszczane w kropli będącej w fazie
metastabilnej.
Kryształy białkowe
Kryształ to obiekt posiadający symetrię translacyjną.
Symetrie tworów skończonych to tzw. symetrie punktowe zachowujące przynajmniej jeden punkt w
przestrzeni (figura przekształca się na siebie). Należą do nich:
Obroty o kąt
, najczęściej równa się 2, 3, 4, lub 6.
Inwersje względem punktu 0 — przekształcenie, w którym punkt P
1
przechodzi w punkt P
2
,
takie, że OP
1
=-OP
2
.
Obroty inwersyjne — złożenie obrotu i inwersji względem punktu leżącego na osi obrotu.
Odbicie zwierciadlane — złożenie obrotu dwukrotnego i inwersji.
Symetrie tworów nieskończonych (figura przekształca się na sąsiednią)
translacje,

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika:

Zgłoś jeśli naruszono regulamin