Ćwiczenia 11-13.doc

METODY GENETYCZNE W MIKROBIOLOGII

1.     Zalety stosowania metod molekularnych w mikrobiologii:

a)      szybkość wykrywania ustrojstw (w tym wirusów, co jest najczęściej niemożliwe przy metodach klasycznych)

b)      brak konieczności prowadzenia hodowli

·         dzięki temu można wykryć ustrojstwa, które rosną zbyt wolno lub mają zbyt duże wymagania hodowlane

c)      ilościowe oznaczenie drobnoustroju

d)      wysoka specyficzność i czułość

e)      stosunkowo niski koszt

f)        mały nakład pracy

2.     Genom bakteryjny:

a)      organizacja strukturalna:

·         genomy wielochromosomowe – czyli ten główny KOLISTY glut, który koduje najważniejsze informacje konieczne do przeżycia

·         genomy plazmidowe – KOLISTE lub LINIOWE cząsteczki DNA znajdujące się poza chromosomem i kodujące dodatkowe informacje (geny oporności na antybiotyki etc.), mogą się same dzielić

b)      co właściwie jest w tych genach, czyli rodzaje informacji genetycznej u bakterii:

·         sekwencje kodujące białka o strukturze kompaktowej

·         sekwencje kodujące RNA

·         pseudogeny

·         sekwencje powtarzające się (głównie te rozproszone)

·         transpozony – elementy ruchome zintegrowane z genomowym DNA

3.     Żeby zbadać DNA bakterii trzeba najpierw je wyizolować:

a)      oczyszczenie i rozdrobnienie materiału

b)      homogenizacja, czyli fizyczne zniszczenie błony/ściany komórkowej

c)      uwolnienie DNA do roztworu – czyli rozbicie kompleksu DNA białko – możliwe dzięki odpowiednim składnikom buforu, w którym etap zachodzi:

·         SDS – sól sodowa siarczanu dodecylu – wiązanie z białkami

·         EDTA – chelatowanie jonów dwuwartościowych

·         Tris – utrzymuje stałe pH, żeby zmniejszyć oddziaływania elektrostatyczne między DNA a białkami (i wtedy łatwiej jest je od siebie oddzielić)

d)      usunięcie wszystkiego co nie jest DNA poprzez ekstrakcję z:

·         fenolem (pH=7) à usunięcie białek

·         chloroformem à usunięcie lipidów, fenolu

·         alkoholem izoamylowym à stabilizacja granicy faz

e)     tak otrzymany DNA zagęszczamy i przechowywujemy w odpowiednim środowisku:

·         etanol/izopropanol (lub inny rozpuszczalnik organiczny) à zmniejsza polarność środowiska, a tym samym utrudnia rozpuszczenie DNA

4.     Wyizolowany DNA poddajemy reakcji PCR – amplifikacji wybranych fragmentów DNA w warunkach in vitro

a)      substraty i inne konieczne rzeczy:

·         matryca DNA

·         dNTP

·         polimeraza Taq

·         kationy Mg2+

·         bufor

b)     przebieg:

·         denaturacja wstępna (92-95°C)

·         cykl właściwy (za każdym razem ilość DNA jest podwajana (zależność 2 x, gdzie x – liczba cykli)

·         synteza końcowa (68-72°C)

·         teraz powtarzamy cykl, aż uzyskamy tyle DNA ile chcemy (zazwyczaj 30 cykli, nooo…. od 25 do 35)

·         przechowywanie gotowego produktu 4°C (-20°C)

c)     wykorzystanie – do wykrywania:

·         wirusa HPV (brodawczaka ludzkiego)

·         wirusa HBV (zapalenia wątroby typu B) – o tyle ważne, że pacjent zakażony HBV wcale nie musi mieć markerów serologicznych wirusa we krwi – a dzięki PCR mamy pewność

·         Chlamydia trachomatis (stany zapalne dróg rodnych à powikłania ciąży/niepłodność)

·         Mycoplasma pneumoniae (zapalenie oskrzeli i płuc)

5.     ELEKTROFOREZA:

a)      DNA i RNA posiadają ładunek ujemny, więc w polu magnetycznym będą migrować w kierunku elektrody dodatniej, czyli ANODY (teraz to już jest pewność)

·         migracja zachodzi w żelu agarozowym lub akrylamidowym zanurzonym w buforze przewodzącym prąd

·         w zależności od ładunku i masy cząsteczka DNA będzie migrowała wolniej lub szybciej

b)      Cząsteczki o wielkości do 20 kpz są rozdzielane na podstawie masy w stałym polu elektrycznym zgodnie z efektem ładunku

c)     ELEKTROFOREZA PULSACYJNA (PFGE) – stosowana do rozdzielania dużych fragmentów DNA (powyżej 20 kpz), które mogą się rozdzielać niezależnie od masy i ładunku

·         metoda polega na okresowych zmianach w przyłożonym napięciu à zmiany konformacji cząsteczek à migracja zgodnie z wielkością

6.     SEKWENCJONOWANIE:

a)      replikujemy jedną nić DNA w taki sposób, żeby otrzymać fragmenty DNA różniące się od siebie długością tylko 1 nukleotydu.

·         skoro replikujemy tylko 1 nić, to potrzebujemy 1 starter

b)      jak to jest, że nie zsyntetyzuje całe DNA, tylko są fragmenty o różnych długościach?

·         w mieszaninie reakcyjnej znajdują się 4 rodzaje dideoksyNTP (ddNTP), które nie posiadają grupy 3’OH

·         taki ddNTP przyłącza się zamiast „klasycznego” nukleozydu do nowej nici, a następny się już nie przyłączy, bo nie ma grupy, która tworzy wiązanie (3’OH)

c)      wizualizacja:

·         każdy ddNTP jest oznaczony innym barwnikiem fluoryzującym

·         w sekwenatorze kapilarnym fragmenty migrują w żelu i się rozdzielają (układają się według długości)

·         po zadziałaniu wiąski lasera ostatnie nukleotydy (czyli te nasze ddNTP właśnie) zaczynają „świecić” odpowiednim dla siebie kolorkiem