PCR
Technika biologiczna która w krótkim czasie pozwala na powielenie dowolnej ilości DNA.
Metoda ta wykorzystuje 3 podstawowe reakcje: denaturacje renaturacje i syntezę DNA które są wielokrotnie cyklicznie powtarzane. Do przeprowadzenia PCR potrzebne są: wzorcowe DNA (matryca) zawierające określoną powielaną sekwencje DNA para krótkich jednoniciowych oligonukleotydów starterowych (primerów) które wiążą się z komplementarnymi sekwencjami zasad po obu stronach powielanego DNA oraz trifosforany deoksyrybonukleozydów jako aktywowane podstawowe elementy budowy DNA a także odpowiednie bufory. Denaturacja prowadzone jest w temp. 92-98C. Renaturacja to jest 55C. Synteza DNA 72C.
Zastosowanie PCR:
-genetyka
diagnostyka chorób dziedzicznych
onkologia
diagnostyka niektórych typów chorób nowotworowych badanie poziomu ekspresji genów
wirusologia
bakteriologia
mykologia
parazytologia
diagnostyka chorób infekcyjnych i inwazyjnych ludzi zwierzat i roslin
erpidemiologia
bad. Epidemiologiczne (epidemia, endemia, pandemia)
transplantologia( uzgodnienie zgodności tkankowych)
medycyna sądowa
archeologia
ustalanie pokrewieństwa
badanie śladów biologicznych
nqauki farmaceutyczne
dziagnostyka preparatów i leków farmaceutycznych
systematyka (taksonomia) -ewolucjonizm badanie pokrewieństwa i przynależności taksonomicznej drobnoustrojów analiza filogenetyczna
mikrobiologia środowiskowa, genetyka populacyjna
badania populacyjne drobnoustrojów
Mikrobiologia żywności
badanie zanieczyszczeń mikrobiologicznych żywności i linii technologicznych w systemie HACCP
Wykorzystanie małej ilości materiału pozwala na szerokie zastosowanie tej metody i jej licznych modyfikacji, masowej identyfikacji czynników chorobotwórczych.
LCR
Reakcja łańcuchowa ligazy, zwana tez czasem analiza ligacji oligonukleotydów jest wysoce swoistym i czułym sposobem wykrywania specyficznejj sekwencji nukleotydowej. Pozwala ona na wykrycie mutacji punktowej polegajacej na zamianie jednego nukleotydu.
Do docelowej sekwencji projektuje się dwa komplementarne, bezpośrednio sąsiadujące z sobą fragmenty DNA (sondy), każdy o długości na przykład 20nukleotydów. Jeśli szukana sekwencja znajduje się w mieszaninie reakcyjnej, wówczas sondy z nią hybrydyzują(łączą się), ustawiając się tuż obok siebie. Obecna w mieszaninie ligaza DNA ma wówczas możliwość utworzenia wiązania chemicznego między obiema sondami i zespolenia ich w jedną cząsteczkę DNA (w tym przykładzie o długości 40 nukleotydów). Etapy hybrydyzacji i ligacji powtarza się wielokrotnie, po czym przeprowadza elektroforetyczny rozdziałmieszaniny w celu sprawdzenia obecności połączonych sond DNA (w tym przykładzie o długości 40 nukleotydów).
TEMPERATURA I CZAS DZIAŁANIA
Temperatura działania
72C przez 30” –3’
16
0
C przez kilka godzin
lub całą noc
KOSZT
Polimeraza jest tańsza
od Ligazy
Ligaza jest droższa
odpolimerazy
CZYNNIK AKTYWUJĄCY
Działanie aktywują jony
Mg
2+
i dNTP
Działanie aktywuje czynnik adenulujący
WYKORZYSTANIE W BIOTECHNOLOGII
Polimeraza jest
narzędziem inżynierii
molekularnej,
wydłużającym łańcuch
DNA
Ligaza jest narzędziem inżynierii molekularnej,
naprawiającym pęknięcia łańcucha DNA
POCHODZENIE ENERGII
Energia działania
pochodzi z wysokiej temperatury
Potrzebuje do działania mnóstwo energii
pochodzenia wirusowego (ATP z bakteriofaga T4 -rozpad) lub bakteryjnego (NAD+
z bakterifaga T4)
CYKLICZNOŚĆ
25–35 cykli powtórzeń
40 cykli powtórzeń
PRAKTYCZNE WYKORZYSTANIE W ŻYCIU CZŁOWIEKA
Wykorzystywany np. w kryminalistyce,
sądownictwie, testach
na ojcostwo
Wykorzystywana w
diagnostyce groźnych patogenów w
fitopatologi isadowniczej
UWARUNKOWANIE DZIAŁANIA
Działanie warunkują
startery 18–30
nukleotydów o podobnej zawartości G
+ C
Działanie warunkuje obecność pęknięcia nici z grupą fosforanową na końcu 5’
SPOSÓB DZIAŁANIA
Startery przyłączają się do przeciwległych
sekwencji w wyniku dodawania
nukleotydów do końca3’ z udziałem
polimerazy
Posiada zdolności naprawcze DNA, łącząc
fragmenty Okazaki w
łańcuchu
Istota różnicy pomiędzy PCR i LCR polega na tym, iż w tej ostatniej metodzie stosuje się nie dwa ale cztery oligonukleotydowe startery, dobrane parami tak, że komplementarne do nich sekwencje są zlokalizowane na analizowanym odcinku DNA w bezpośrednim sąsiedztwie.
Literatura:
Biotechnologia farmaceutyczna Kaysera O. i Mullera R. H. PZWL 2003 Warszawa
Podstawy Biotechnologii Colin Ratledgre PWN 2011
Biotechnologia Podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne PWN 1998
Biotechnologia roslin Malepszy PWN 2009
Biotechnologia roślin Malepszy 2001
marzen.ka.kalbarczyk