Mikołaj Sałek
KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH
Wyznaczanie stałej Michaelisa (Km) na przykładzie kwaśnej fosfatazy (EC 3.1.3.2)
1. Cel doświadczenia:
· Wyznaczanie krzywej standardowej dla p-nitrofenolu
· Badanie wpływu stężenia substratu na aktywność katalityczną kwaśnej fosfatazy. Wyznaczanie stałej Michaelisa (Km).
2. Opis doświadczenia:
Stosujemy metodę, w której naturalny substrat kwaśnej fosfatazy zostaje zastąpiony sztucznym substratem – p-nitrofenylofosforanem (analogiem naturalnego substratu). Enzym hydrolizując p-nitrofenylofosforan, uwalnia p-nitrofenol, który w środowisku zasadowym tworzy żółto zabarwiony anion p-nitrofenolanowy. Enzym był uzyskany z odpowiednio rozcieńczonego wyciągu z ziemniaka.
3. Wykonanie:
· Wyznaczanie krzywej standardowej dla p-nitrofenolu:
Tabela nr. 1
· Sporządzenie wykresu szybkości reakcji od stężenia substratu:
Nr. Próby
A
A'
Aśr
Stężenie substratu [mM]
Aktywność
1
0,228
0,207
0,2175
0,1
0,95903
2
0,343
0,334
0,3385
0,2
1,492559
3
0,463
0,473
0,468
0,3
2,063568
4
0,547
0,532
0,5395
0,4
2,378835
5
0,613
0,587
0,6
0,5
2,6456
6
0,806
0,817
0,8115
3,578174
7
1,060
1,028
1,044
4,603344
8
1,188
1,127
1,1575
5,103803
9
1,314
1,057
1,1855
5,227265
· Sporządzenie wykresu Lineweavera-Burka:
1/S
1/V
60
1,042720249
30
0,669990115
20
0,484597551
15
0,42037378
12
0,37798609
0,279472155
0,217233385
0,195932315
1,5
0,191304643
Tabela nr. 4
Km = -(-1/11,9) = 0,084mM
Vmax = 5,4318 [umol/min/0,5 ml]
· Sporządzanie wykresu Eadie-Hofstee:
Rainhardt