IG notatki LAB.doc

INŻYNIERIA GENETYCZNA L

Przygotowanie komórek kompetentnych XL1-Blue

Komórki kompetentne – komórki zdolne przyjąć obce DNA.Ich przygotowanie – zamrażanie, szok cieplny.

·         Bufor A – jony Mg

·         Bufor B – jony Cl

·         Bufor C – jony Ca, glicerol (20%)

Inokulum- hodowla wstępna, dajemy do niej antybiotyk, aby zablokować rozwój nieporządanych mikroorganizmów, albo rozwijać tylko te mikroorganizmy, które są odporne na specyficzne antybiotyki.

Liczenie rozcienczenia:

Stezenie wyjściowe=12,5mg/ul

stezenie koncowe ma byc= 12,5ug/ul

R=Co/Ck= 12500/ 12,5= 1000

Vkoncowe= 70ml

Vpoczatkowe antybiotyku= Vk/R= 70/1000=70 ul

Kompetencja- zdolność komórek do pobrania materiału genetycznego z zewnątrz. Może być naturalne i prowadzona sztucznie.

Strefy adhezyjne u bakteri- pory, przez które może przeniknąć materiał DNA. Błonę należy zobojętnić, ponieważ jest naładowana ujemnie. Zobojętniamy ją np. jonami wapni, aby wprowadzić DNA do środka. Obniżamy temperaturę i błonę wtedy łątwiej opłaszczyć. W ukompetententnianiu używamy jonów magnezu i wapnia. Gdy następuje podwyższenie temperatury, usztywniona komórka się rozluźnia i wtedy może przyjąć DNA.

Czysta kultura- wszystkie kopie komórek pochodzą od hodolwi macierzystej

              Glicerol zwiększa gęstość, żeby białka bakteryjne i oddziaływania między białkami były bardziej stabilne. Glicerol chroni komórki – zapobiega lizie.

Jony są potrzebne do neutralizacji  ładunku błony.
Temperatura – jej obniżanie powoduje, że błona jest bardziej przepuszczalna i sztywna. Podniesienie temperatury powoduje rozciąganie się błony, dzięki czemu może wejść DNA.

Błona komórkowa – fosfolipidy (P – ładunek ujemny)

Transformacja DNA – proces, dzięki któremu DNA jest wprowadzane do bakterii.

OD600 – mówi o rozproszeniu światła. Jest to gęstość optyczna. (komórki kompetentne OD600= 0,4-0,5)

Wykres wzrostu bakterii:

I – faza adaptacyjna (komórki nie dzielą się)

II – faza logarytmiczna (największy wzrost komórek)

III – faza stacjonarna (ilość komórek powstających i umierających jest taka sama)

IV – faza zamierania

X-Gal – pochodna laktozy. Β-galaktozydaza hydrolizuje X-Gal do galaktozy i glukozy.

Galaktoza daje kolor niebieski. Kolonie dobrze stransformowane widać na płytce jako kolonie niebieskie (rozkładają X-Gal)

transpozon – gen ruchomy

Transformacja- proces aktywnego pobierania materiału genetycznego z zewnątrz (prokariota)

transfekcja –- proces aktywnego pobierania materiału genetycznego z zewnątrz u organizmów eukartiotycznych

Transdukcja- przekazania materiału genetycznego z jednego prokariota do drugiego za pomocą wirusa

Metody wszczepiania genów do komórek eukariotycznych:

-         Elektroporacja – poddawanie komórek działaniu pola elektrycznego, dzięki czemu tworzą się odwracalne pory.

-         Mikroiniekcja – wszczepianie DNA, bombardowanie błony komórkowej w polu elektrycznym (błona komórkowa jest otoczona złotem lub wolframem).

-         Liposomy – pęcherzyki lipidowe, które mogą powstawać w fosfolipidów, są to wodne przestrzenie ograniczone dwuwarstwą lipidową, mogą służyć do badania przepuszczalności błon czy do dostarczania komórkom różnych związków chemicznych

-         Działanie dekstranem i fosforanem wapnia

-         Transdukcja – wprowadzenie DNA do komórki bakteryjnej za pomocą bakteriofagów

-         U roślin musimy zrobić protoplastyzację, żeby zniszczyć ścianę komórkową.

Plazmid – kolisty fragment DNA pełniący funkcje chromosomów pomocniczych; służą jako wektory do klonowania DNA w bakteriach. 

Komórki bakteryjne zawierają DNA koliste, które łatwiej przenika i łatwiej się łączy. Komórka bakteryjna nie przyjęłaby DNA liniowego.

Enzymy restrykcyjne – białka pochodzące z bakterii, które wykorzystują te enzymy, by bronić się przed obcym DNA. Enzymy restrykcyjne nie tną DNA gospodarza ponieważ jest ono zmetylowane. Restryktazy generują lepkie końce.

-         BamHI – rozpoznaje sekwencje G▼CCGC, tnie DNA tworząc lepkie końce

-         EcoRI – tnie DNA tworząc lepkie końce, 5'-G▼AATTC-3', tnie tworząc 3 fragmenty

-         HindIII – tnie tworząc 2 fragmenty

Metylazy – metylują w rozpoznawanej sekwencji 1 resztę DNA, dzięki czemu DNA bakteryjne nie jest cięte przez enzymy restrykcyjne

METYLACJA

• U prokariota

dam – nie pokrywa miejsca metylacji

dcm – może pokrywać miejsce metylacji

• U eukariota

Metylacja ta służy do wybierania DNA, które ma być czynne restrykcyjnie.

DNA niezmetylowane – ulega ekspresji

DNA zmetylowane - nieaktywne

Ligaza DNA – łączy końce DNA w regionach dwuniciowych. Enzym ten katalizuje tworzenie się wiązania fosfodiestrowego między grupą 3'-OH jednego końca nici DNA i grupą 5'-fosforanową na końcu drugiej nici. Do przeprowadzanie tej reakcji potrzebne jest źródło energii:

-         u eukariotów i archeonów – ATP

-         u bakterii – NAD+

Znaczenie markerów genetycznych:

-         endA1 – mutacja genu endonukleazy A (endonukleaza A tnie DNA) specyficznej dla DNA, zwiększająca wydajność i jakość izolowanych plazmidów (chodzi o to, żeby nasze plazmidy nie były rozcinane)

-         lacIq – zdolność do nadprodukcji lac represora hamującego transkrypjcę z promotorów zawierających lac operator (bo nie chcemy, żeby komórka sama transkrybowała laktozę)

-         recA1 – niezdolność do rekombinacji DNA; zwiększa stabilność niektórych insertów podczas propagacji wektorów (chodzi o to, żeby nasze plazmidy nie były rozcinane)

-         TcR – obecność genu tet, nadającego oporność na terracyklinę (tertacyklina jest markerem selekcyjnym, nietranformowane komórki nie wyrosną na płytce gdy jest ona obecna w podłożu)

Operon laktozowy:

Enzym I – β-galaktozydaza

Enzym II – permeaza

Enzym III – acetylotransferaza

Aktywność enzymów restrykcyjnych zależy od:

-         czystości DNA – zanieczyszczenia DNA wpływające na aktywność enzymu: białka, fenol, chloroform, etanol, EDTA, SDS, wysokie stężenie soli

-         temperatura i czas inkubacji

-         dobór buforu

* Mg2+ - niezbędne do aktywności enzymu

* Tris-HCl – utrzymanie odpowiedniego pH

*Kcl/NaCl – odpowiednia siła jonowa

*BSA – stabilizacja cząsteczek białkowych, zapobieganie adhezji enzymów do probówki

*Triton X-100 – detergent, stabilizacja białek

Aktywność gwiezdna – tzw. „rozluźniona” specyficzność enzymu będąca skutkiem nie optymalnych warunków, utrata specyficzności działania:

-         za duże stężenie glicerolu

-         zbyt wysokie pH

-         jeden kofaktor (Mn jest zastąpiony innym)

-         za długa inkubacja

-         zła temperatura

-         za duża ilość enzymu lub substratu

-         zbyt niska siła jonowa

Metody inaktywacji enzymu:

-         elektroforeza

-         termicznie – 80°C, 30 minut ← podstawowy sposób

-         chemicznie (EDTA, fenol, chloroform, EtOH)

Jednostka aktywności – taka ilość enzymu, która trawi całkowicie 1 μg charakterystycznego substratu testowego przez 1h w optymalnych warunkach podanych przez producenta.

Elektroforeza preparatywna – oczyszczenie pożądanego DNA z innych pasm DNA

Po ligacji:

-         wysiewamy pożądane DNA na bakterie

1) DNA superskręcone →  najbardziej niebezpieczne

2) wektor + insert

3) wektor bez insertu → niebezpieczne

4) DNA liniowe

-         wycinami DNA z żelu

Elektroforeza:                                                                                                          DNA

-         agaroza = galaktoza D + galaktoza L                         |+|   ←   |-| (bo DNA ma ładunek|-|)

-         rozdział molekuł w polu elektrycznym następuje na podstawie ich wielkości, kształtu i ładunku. DNA przemieszcza się w polu elektrycznym od ujemnej elektrody katody (-) do dodatniej elektrody anody (+).

-          

FORMY DNA:

-         -liniowe -> nie zostaną powielone przez bakterie, gdyż one mają DNA koliste

-         - koliste                           =>

-         - koliste superskręcone   =>   musimy je oczyścić, bo zostaną powielone przez bakterie

Elektroforeza jest techniką do rozdziału molekuł w polu elektrycznym na podstawie wielkości, kształtu i ładunku. DNA przemieszcza się od (-) katody do (+) anody.

Gdy mamy cząsteczki DNA podobnej długości- potrzebne większe stężenie agarozy.

Czynniki wpływające na ruchliwość DNA kolistego/liniowego w żelu agarozowym:

-         długość cząsteczki DNA – im dłuższa tym wolniej migruje   V=1/[log(bp)]

-         konformacja

* koliste superskręcone – najszybciej

*koliste -  średnia prędkość

* liniowe - najwolniej

-         bromek etydyny – wchodzi między pary zasad (interkaluje), wiec spowalania czasteczki liniowe

* kolisty ujemnie superskręcony – bromek etydyny dodaje skręty dodatnie

7 (-) superskręconych → 7 (+) superskręconych         prędkość nie zmienia się

1 (-) superskręconych → 3 (+) superskręconych                 prędkość zwiększa się

6 (-) superskręconych → 3 (+) superskręconych                 prędkość zmniejsza się

* liniowy

bromek etydyny wysłuża i usztywnia DNA, co zmniejsza prędkość

-         napięcie – im większe tym szybciej migrują, ale spada rozdzielczość

-         stężenie agarozy – im bardziej stężona tylko wolniej migrują, ale jest lepsza rozdzielczość

-         bufor (siła jonowa)

ELEKTROFOREZA SDS-PAGE → Elektroforeza w warunkach denaturujących (bo jest SDS)

SDS- Sodium Dodecyl Sulfate

żele:

-         12%- żel dolny, rozdzielający

-         4% - żel górny, zagęszczający

MIX = akryloamid + bisakryloamid

Bufory: UPPER

              LOWER