1. Metody unieruchamiania (immobilizacji) enzymów
a) Polegające na przyłączeniu enzymu do powierzchni nośnika
· Dzięki fizycznej adsorpcji biokatalizatora
· Wiązanie z udziałem oddziaływań jonowych przez wytworzenie wiązań kowalencyjnych
· Jeśli bezpośrednia reakcja nie jest możliwa stosuje się substancje posiadające co najmniej 2 grupy chemiczne zdolne do reakcji z nośnikiem i z enzymem
· Substancje te zwiększają odległość pomiędzy cząsteczkami unieruchomionego enzymu a powierzchnią nośnika ułatwiając dostępu substratom do centrum katalitycznego
b) Z zastosowaniem sorbentów
· Gdy nie ma potrzeby zbyt trwałego wiązania enzymu
· Ich zaletą jest nieskomplikowana procedura i możliwość łatwej regeneracji poprzez wymycie nieaktywnego już białka
· Brak zmian struktury cząsteczek enzymu
· Niewielka energia wiążąca białka jest przyczyną szybkiej desorpcji enzymu podczas działania reaktora
c) Oddziaływania jonowe
· Powodują silniejsze unieruchamianie enzymów
· Występują w zakresie pH przy którym zarówno enzym jak i nośnik uzyskują ładunek elektryczny
· Jeśli gr funkcyjne enzymu i nośnika mają ładunek jednakowego znaku do zaistnienia wiązania niezbędne są dwuwartościowe kationy, sprzęgające białko za pośrednictwem mostków solnych
· W przypadku stosowania silnych kationów lub anionitów poszerza się zakres wartości pH przy których występuje jonowe wiązanie enzymu
· Przykłady nośników: z wiązaniami sulfonowymi
d) Wiązania kowalencyjne
· Nie powodują zmniejszenia aktywności operacyjnej preparatu na skutek desorpcji enzymów
· Nie powodują denaturacji białka
· Odbywa się z udziałem białkowych reszt lizyny, argininy, cysteiny, tyrozyny, kwasów glutaminowego i asparaginowego, aminokwasów znajdujących się w pozycji N- lub C-terminalnej
· Jako nośniki: polimery zawierające wolne grupy aminowe, umożliwiające sprzęganie białka enzymatycznego w łagodnych warunkach za pośrednictwem aldehydu glutarowego
· Wada: tworzenie oligomerów o zróżnicowanej długości cząstek, zmniejszenie aktywności preparatu spowodowane zmianami struktury cząstek białka i ograniczeniem dostępu substratu do centrum katalitycznego
e) Wiązania wytworzone z substancjami dwufunkcyjnymi
· Powodują otrzymywanie nierozpuszczalnych preparatów enzymatycznych
· Substancje dwufunkcyjne: aldehyd glutarowy, polialdehydy, kwas bis-diazobenzydynosulfanowy
· Preparaty różnią się od siebie: aktywnością, termo stabilnością, odpornością na działanie substancji denaturujących białka, stopniem uwodnienia, wielkością ziaren i wytrzymałością mechaniczną
f) Sieciowanie bialek
· Powoduje uwodnienie precypitatu, niewielką wytrzymałość mechaniczną, zróżnicowanie wielkości ziaren
· Unieruchomiony w ten sposób enzym charakteryzuje się polepszoną termo stabilnością, trudnością w wytworzeniu preparatu o powtarzalnych właściwościach
· Wady: powolna precypitacja wytworzonych agregatów, zmniejszenie aktywności enzymu
g) Sieciowanie kryształów białka lub agregatów jego cząsteczek
· Korzystne właściwości katalityczne bialek enzymatycznych agregowanych za pomocą aldehydu glut arowego
· Uzyskane preparaty składają się z prawie czystego białka, wykazują dużą aktywność, odporność na działanie czynników denaturujących
· Liczne oddziaływania elektrostatyczne, hydrofobowe w kryształkach
· Krystaliczna struktura utrudnia inaktywację
· Warunkiem rozpowszechniania tej metody jest:
* Polepszenie sposobów wydajnego uzyskiwania kryształów białek o optymalnym kształcie i wielkości
* Dostępność przenikających ich strukturę kanałów, ułatwiających penetrację roztworu substratu
· Wady: niewielkie rozmiary cząsteczek usieciowanych kryształów, zwiększenie oporów przepływu substratu w reaktorach kolumnowych
h) Sieciowanie precypitatu strąconego w niedenaturujących warunkach roztworów soli, rozpuszczalnikami organicznymi, bądź polimerami niejonowymi
· Zalety: możliwość regulacji ich specyficzności poprzez wybór odpowiedniej substancji strącającej i warunków procesu
· Możliwość uzyskania z tego samego enzymu preparatów o rożnym powinowactwie do substratów i odporności na działanie inhibitorów
i) Błony o selektywnej przepuszczalności
· Spełniające funkcję separacyjną albo separacyjną i katalityczną
· Aktywność zależy od szybkości dyfuzji substratu i produktu reakcji przez membranę
· Membrany bez enzymu służą do zamknięcia roztworu biokatalizatora w mikrokapsułce lub w module reaktora
· Do mikrokapsulek konieczne jest stosowanie blon przepuszczających cząsteczki substratów i produkty reakcji
· Membrany zatrzymujące tylko cząsteczki substratu przydatne są do oddzielenia produktów reakcji od mieszaniny reakcyjnej zawierającej enzym
j) Pułapkowanie (inkluzja)
· Zachodzi w żelu wytwarzanego po zmieszaniu roztworów enzymu i substancji żelującej
· Mała energia oddziaływań wiążących
· Łatwe wymywanie biokatalizatora
· Szybki spadek aktywności preparatu
· Zmiany właściwości wyrobu
· Nie nadaje się do immobilizacji hydrolaz oraz w przypadku gdy substraty lub produkty reakcji z trudnością migrują w strukturze polimeru
2. Im mobilizowane enzymy
- Preparaty wytworzone przez połączenie biokatalizatora z nośnikiem nierozpuszczalnym w środowisku reakcji
- Nierozpuszczalne agregaty cząsteczek
- Nierozpuszczalne agregaty kryształów białek
- Enzymy zamknięte w strukturze żelu
- Enzymy oddzielone od środowiska reakcji półprzepuszczalnymi membranami
3. Zalety unieruchamiania enzymów
- Stabilizacja struktury biokatalizatora przeciwdziałająca niekorzystnemu wpływowi środowiska
- Wzrost odporności preparatu na działanie podwyższonej temperatury, rozpuszczalników organicznych i substancji denaturujących
- Obniżenie inhibicji produktami reakcji
- Zmiana specyficzności względem inhibitorów
4. Wady
- Utrudniona oscylacja zmiany cząsteczek biokatalizatora podczas reakcji
- Ograniczony dostęp substratu do cząsteczek enzymu
- Obniżenie aktywności preparatu
- Obniżenie powinowactwa enzymu do substratu
- Stopniowe zmniejszanie aktywności katalitycznej enzymu
- Blokowanie enzymu cząsteczkami produktu
- Adsorpcja zanieczyszczeń działających jako inhibitory
- Rozwój drobnoustrojów
- Pozorna zmiana optymalnego pH działania enzymu
- Zmniejszenie powinowactwa enzymu do posiadających ładunek elektryczny cząsteczek substratu
5. Stosowane nośniki
- Dostosowane do:
a) Temperatury
b) Kwasowości
c) Lepkości
d) Polarności środowiska reakcji
e) Konstrukcji używanego reaktora
- Przydatność substancji jako nośnika zależy od:
a) Powierzchni właściwej
b) Rozmiarów Ziarek
c) Porowatości
d) Wytrzymałości mechanicznej
e) Ilości dostępności i rodzaju grup funkcyjnych wiążących enzym
f) Zawartości grup hydrofilowych i hydrofobowych
- Modyfikacje
a) Pokrywanie nośników warstwą reagującego z bialkiem polimeru
b) Wbudowywanie pożądanej grupy chemicznej podczas syntezy nośnika
- Rodzaje
a) Unieruchamianie w środowisku wodnym za pomocą nośników katalizowanymi lipazami
· Emulgatory
· Środki pianotwórcze
· Środki żelujące
· Surfaktany
b) Porowate
· Zalety: duża pwierzchnia kontaktu ze środowiskiem reakcji
· Wady: nasilenie oporów dyfuzyjnych, utrudniony transport substratów i produktów katalizowanego procesu
c) Polimery i kopolimery syntetyczne
· Właściwość i pojemność enzymatyczna dostosowana do projektowanego procesu
· Poliakryloamidy poliamidy, pochodne polistyrenu, poliakrylonitrylu lub alkoholu poliwinylowego
· Kopolimery z grupami bezwodnikowymi
d) Polimery pochodzenia naturalnego
· Niski koszt
· Eliminacja niebezpieczeństwa zanieczyszczenia produktu pozostałością substancji
· Polisacharydy, bialka
· Związki nieorganiczne tj szkło porowate, żel krzemionkowe
· Zapewniają kontrolę liczebności, rozmiarów porów
· Nie ulegają degradacji w szerokim zakresie pH i T
· Odporne na mikrobiologiczne degradacje
e) Nieorganiczne adsorbenty
· Szkło porowate
· Żel krzemionkowy
· Tlenki metali
· Glinokrzemiany
· Substancje ceramiczne
f) Ferromagnetyczne
· Usuwane z cieczy poreakcyjnej pod wpływem pola magnetycznego
- Cechy
...
Elesmera