1. Systemy współzależności między drobnoustrojami: podział oddziaływań, rodzaje interakcji, charakterystyka i przykłady oddziaływań pośrednich.
O układzie drobnoustrojów poza czynnikami środowiskowymi decydują wzajemne stosunki pomiędzy poszczególnymi gatunkami biocenozy. Wzajemne oddziaływania miedzy mikroorganizmami podzielić można na:
§ Bezpośrednie (symbioza, pasożytnictwo, drapieżnictwo)
§ Pośrednie (protokooperacja, komensalizm, konkurencja, amensalizm).
Populacje występujące w biocenozie mogą na siebie wzajemnie oddziaływać. Interakcje mogą być protekcyjne lub antagonistyczne. Przy braku zależności mówimy o neutralizmie.
Do zależności protekcyjnych, nazywanych nieantagonistycznymi, zaliczamy (interakcje dodatnie)
a) symbiozę - która jest rodzajem współżycia organizmów czerpiących obopólne korzyści, np.: bakterie brodawkowe i korzenie roślin motylkowych. Jeśli występuje rodzaj współżycia tzw. koniecznego, wówczas ten układ nazywamy mutualizmem - przykładem są porosty, których ciało zbudowane jest z glonów i skrzepek grzyba.
b) komensalizm - jeden z występujących organizmów w układzie jest komensalem, czerpiącym korzyść z obecności drugiego osobnika, tzw. gospodarza, który nie ponosi szkód, np.: Lactococcus i Lactobacillus w mleku
c) protokooperację - dotyczy dwóch organizmów świadczących sobie wzajemnie usługi, "korzyści", ale nie jest to konieczne do ich egzystencji.
Do zależności antagonistycznych zaliczamy (interakcje ujemne)
a) Konkurencję - Jest formą współżycia, w której obydwaj partnerzy współzawodniczą o deficytowy i ważny dla nich składnik pokarmowy bądź też o światło, wodę czy przestrzeń życiową. Konkurencja występuje tylko w takich przypadkach, gdy zasoby substancji potrzebnej dla rozwoju obydwu grup są zbyt małe, aby zabezpieczyć potrzeby współistniejących mikroorganizmów. Współzawodniczące mikroorganizmy nie szkodzą sobie nawzajem, lecz walczą o zaspokojenie własnych potrzeb.
b) Pasożytnictwo jest rozumiane, jako współzależność, w której jeden z partnerów (pasożyt) osiąga korzyści, natomiast drugi partner (gospodarz) nie ponosi lub ponosi szkody. W pierwszym przypadku pasożytnictwo dotyczy rozkładu martwych szczątków roślin czy zwierząt. Ten rodzaj pasożytnictwa jest szeroko rozpowszechniony w przyrodzie i jest decydującym dla zapewnienia obiegu pierwiastków. Drugi rodzaj pasożytnictwa występuje wtedy, gdy gospodarzem jest organizm żywy. W świecie mikroorganizmów tego rodzaju pasożytnictwo jest stosunkowo mało poznane. Przykładem mogą być bakteriofagi atakujące komórki bakterii.
a) Drapieżnictwo – jest systemem, który rozumiany jest najczęściej jako odżywianie się jednych mikroorganizmów innymi. W świecie zwierząt jest to system współzależności bardzo często spotykany, natomiast między mikroorganizmami należy do rzadkości. Najbardziej typowym przykładem pasożytnictwa u mikroorganizmów jest odżywianie się pierwotniaków bakteriami. Jest to zjawisko szczególnie widoczne w zbiornikach wodnych, osadach czynnych, ściekach. Główną rolę w eliminowaniu bakterii ściekowych przypisuje się orzęskom i wiciowcom.
b) Amensalizm - jest forma współzależności, w wyniku której rozwój jednej populacji jest zahamowany przez substancje wytwarzane przez partnera. W tym środowisku drapieżnictwo pierwotniaków jest uznawane jako efekt korzystny, pozwalający na redukcje substancji antagonistycznych może być korzystne dla wytwarzającego je mikroorganizmu. Osłabianie szybkości wzrostu wrażliwych partnerów lub ich eliminowanie daje producentowi szanse uzyskania przewagi w ekosystemie i ekspansji środowiska. Często substancje antagonistyczne są traktowane jako "broń" mikroorganizmów w walce o przetrwanie w środowisku.
c) Antybioza - wytwarzanie antybiotyków (związków chemicznych) przez jedna grupę bakterii powoduje zahamowania wzrostu innej.
Systemy oddziaływania bezpośredniego.
Symbiozą nazywamy taki rodzaj współzależności dwóch lub więcej różnych gatunków ściśle od siebie zależnych, które bez obecności partnera rozwijają się bardzo słabo lub wcale nie rosną. Taki rodzaj współzależności jest również nazywany mutualizmem. Znane są przykłady oddziaływania symbiotycznego między samymi mikroorganizmami, jak i miedzy mikroorganizmami i organizmami wyższymi w tym również człowiekiem.
Główne kierunki korzystnego oddziaływania na siebie symbiontów są wynikiem:
a) Wymiany składników pokarmowych;
b) Przekształcania przez mikrosymbionty nieprzyswajalnych dla organizmu wyższego substancji pokarmowych;
c) Dostarczania substancji wzrostowych;
d) Zaopatrywania w składniki mineralne;
e) Wykorzystywania i w ten sposób usuwania produktów metabolizmu toksycznych dla organizmu partnera;
f) Ochrony przed szkodliwymi czynnikami środowiskowymi;
g) Zmiany parametrów środowiska;
Pasożytnictwo - jest rozumiane jako współzależność, w której jeden z partnerów (pasożyt) osiąga korzyści, natomiast drugi partner (gospodarz) nie ponosi lub ponosi szkody. W pierwszym przypadku pasożytnictwo dotyczy rozkładu martwych szczątków roślin czy zwierząt. Ten rodzaj pasożytnictwa jest szeroko rozpowszechniony w przyrodzie i jest decydującym dla zapewnienia obiegu pierwiastków. Drugi rodzaj pasożytnictwa występuje wtedy, gdy gospodarzem jest organizm żywy. W świecie mikroorganizmów tego rodzaju pasożytnictwo jest stosunkowo mało poznane. Przykładem mogą być bakteriofagi atakujące komórki bakterii.
Drapieżnictwo - jest systemem, który rozumiany jest najczęściej jako odżywianie się jednych mikroorganizmów innymi. W świecie zwierząt jest to system współzależności bardzo często spotykany, natomiast między mikroorganizmami należy do rzadkości. Najbardziej typowym przykładem pasożytnictwa u mikroorganizmów jest odżywianie się pierwotniaków bakteriami. Jest to zjawisko szczególnie widoczne w zbiornikach wodnych, osadach czynnych, ściekach. Główną rolę w eliminowaniu bakterii ściekowych przypisuje się orzęskom i wiciowcom.
Systemy oddziaływania pośredniego.
Oddziaływanie pośrednie, zachodzące poprzez środowisko. Warunek: odpowiednio bliskie sąsiedztwo organizmów, tak by stworzone metabolity czy zmiany parametrów fizycznych środowiska mogły wywierać wpływ na partnerów. Efekt: zwiększenie/osłabienie wzrostu lub brak wpływu.
W przyrodzie współzależności miedzy mikroorganizmami zachodzące poprzez środowisko występują niezwykle często. Warunkiem niezbędnym jest jednak odpowiednio bliskie sąsiedztwo organizmów, tak, aby tworzone metabolity czy zmiany parametrów fizycznych środowiska mogły wywierać wpływ na partnerów.
Protokooperacja - Jest często określana jako pośrednia symbioza. Jest to system, w którym wszystkie powiązane ze sobą mikroorganizmy odnoszą korzyść. W tym systemie nie ma konieczności współistnienia, jednakże wspólne bytowanie jest korzystne dla partnerów i objawia się zwiększeniem szybkości wzrostu i wyższą aktywnością metaboliczna, większą ekspansywnością w środowisku lub większą tolerancja na zmienione warunki bytowania.
Współzależności protokooperacyjne polegają na:
a) Wzajemnym uprzystępnianiu składników pokarmowych
b) Wzajemnej wymianie gazów, najczęściej dotyczy to CO2 i O2
c) Wytwarzaniu i wzajemnej wymianie substancji wzrostowych przez partnerów zespołu
d) Wytwarzaniu substancji stymulujących wzrost i usuwaniu metabolitów toksycznych przez współbytując mikroorganizmy.
Komensalizm - Oznacza współzależność, w wyniku której jeden z partnerów odnosi korzyści, natomiast drugi nie podlega wpływowi, istnienie partnera jest dla niego obojętne. Jest to tzw. jednostronna korzyść, z reguły tego typu zależności są w małym stopniu swoiste. Komensalizm najczęściej polega na:
a) Przeprowadzeniu przez jednego z mikroorganizmów substratów pokarmowych, nieprzyswajalnych przez partnera, w produkty, które już może wykorzystać jako składniki odżywcze;
b) Tworzeniu przez jednego ze współmieszkańców ekosystemu substancji wzrostowych, np. witamin, stymulujących wzrost partnerów;
c) Rozkładzie lub wykorzystywaniu w środowisku substancji hamujących wzrost partnerów.
Konkurencja - Jest formą współżycia, w której obydwaj partnerzy współzawodniczą o deficytowy i ważny dla nich składnik pokarmowy bądź też o światło, wodę czy przestrzeń życiową. Konkurencja występuje tylko w takich przypadkach, gdy zasoby substancji potrzebnej dla rozwoju obydwu grup są zbyt małe, aby zabezpieczyć potrzeby współistniejących mikroorganizmów. Współzawodniczące mikroorganizmy nie szkodzą sobie nawzajem, lecz walczą o zaspokojenie własnych potrzeb.
Amensalizm - Często określany jest antagonizmem; jest forma współzależności, w wyniku której rozwój jednej populacji jest zahamowany przez substancje wytwarzane przez partnera. W tym środowisku drapieżnictwo pierwotniaków jest uznawane jako efekt korzystny, pozwalający na redukcje substancji antagonistycznych może być korzystne dla wytwarzającego je mikroorganizmu. Osłabianie szybkości wzrostu wrażliwych partnerów lub ich eliminowanie daje producentowi szanse uzyskania przewagi w ekosystemie i ekspansji środowiska. Jest to szczególnie istotne dla mikroorganizmów wolnorosnących, które mają małe możliwości konkurowania z innymi mieszkańcami biocenozy. Często substancje antagonistyczne są traktowane jako "broń" mikroorganizmów w walce o przetrwanie w
środowisku.
Ćwiczenia:
I Komensalizm
1. przeprowadzić makroskopowe obserwacje mleka świeżego (próba kontrolna) oraz po 2,5,10 dniach inkubacji. Zwrócic uwage na zapach, objawy gazowania, barwę, wygląd skrzepu i powierzchni prób.
2. Przeprowadzić mikroskopowe obserwacje prób. Wykonać bezpośrednie preparaty mikroskopowe z powierzchni prób, a nastepnie po wymieszniu preparaty utrwalone błękitem metylenowym. Na podstawie tych obserwacji wyjaśnić, na czym polega wielostopniowa zależność komensala (metabioza) podczas rozkładu mleka.
Wnioski:
· Próba kontrolna- świeży zapach, barwa biała, wygląd swoisty; drobnoustrojów jest małao i nie można ich zaobserwować
· 2 dni inkubacji (30C)- gęstszy niż próba kontrolna, powstaje skrzep gładki i jednorodny, zapach kwasu mlekowego; występuja ziarniaki (Lactococcus i Lactobacillus); zachodzi fermentacja mlekowa powstaje kwas mlekowy, który zakwasza środowisko
· Inkubacja 5 dni – skrzęp, bardzo ścisła struktura, na powierzchni biały kożuszek, zapach kwaśny: paciorkowce, pałeczki, grzybnia Geotrichum candidum (odkwaszają środowisko)- zachodzi odkwasznie środowiska
· Inkubacja 10-dni- skrzęp ma konsystencja porozrywaną; bakterie proteolityczne z rodzaju Pseudomonas i Bacillus, grzyby pałeczki i ziarniaki; -zachodzi proteoliza rozkład białek
II. Protokooperacja
Do trzech probówek z pożywką zawierającą kazeinian wapnia (źródło węgla i azotu) wysiano: I próba bakterie Bacillus, II próba bakterie Pseudomonas, III próba Bacillus+Pseudomonas. Zaszczepione pożywki inkubowano w 37C w ciągu 48 godzin. Zaobserwować różnice we wzroście, wykonać preparaty barwione metodą Grama.
· I Bacillus- G+(granatowo-fioletowe laseczki, wzrost –biały osad na dnie probówki
· II Pseudomonas- G- , brak wzrostu
· III Bacillus i Pseudomonas- wzrost-kożuszek na powierzchni i zmętnienie na dnie, różowe pałeczki Pseudomonas i fioletowe laseczki Bacillus
Wynika stąd, że Bacillus metabolizuje kazeinian a Pseudomonas nie.
III. Amensalizm
1.Na płytce Petriego zawierającej pożywkę bulionową z dodatkiem agaru wycięto jałowym skalpelem pasek pożywki o szerokości 1 cm, po czym go usunięto. Następnie do rozpuszczonej i ochłodzonej do temp 45C pożywki APL (autoliza drożdżowy, pepton, laktoza)z dodatkiem agaru wysiano 2-3 krople hodowli bakterii kwasu mlekowego Lactococcus lactis. Po wymieszniu wypełniono rowek na płytce. Płytki inkubowano w temp 30C w czasie 48h. Następnie na płytce wysiano ezą hodowlę bakterii proteolitycznych Bacillus i Pseudomonas, po czym inkubowano w temp 30C w czasie 48h
Lactococcus wytwarza bakteriocyny, które hamuja wzrost bakterii proteolitycznych, działa na G+ i G-.
2.Na płytce z uprzednio wysianymi promieniowcami z rodzaju Strptomyces prostopadle do ich linii wzrostu wysiano ezą hodowle bakteri gatunku Pseudomonas i Bacillus, a następnie poddano i inkubacji w 30C w czasie 48h.
Promieniowce również zahamowały wzrost jednego i drugiego szczepu. Produkują one antybiotyki (streptomycyna), które działają na G+ i G-, ale silniej działają na G+.
2. Naturalny układ mikroflory w surowcach pochodzenia roślinnego i zwierzęcego: czynniki warunkujące jakość mikrobiologiczną surowców spożywczych, charakterystyczna mikroflora surowców, przemiany biochemiczne zachodzące w surowcach, skuteczność termicznych metod utrwalania surowców.
W zależności od rodzaju owoców wartość pH wynosi 3-5 a warzyw 4,7-7. Sacharydy występują w postaci mono i polisacharydów, głównie glukozy, fruktozy, sacharozy, skrobi i celulozy. Kwasy organiczne w tym głównie jabłkowy, cytrynowy, winowy, szczawiowy, salicylowy nadają owocom i warzywom odpowiedni skład. Owoce i warzywa są ubogie w lipidy. Warzywa zawierają na ogół więcej białka niż owoce. W niektórych warzywach tj czosnek, chrzan, cebula występują fitoncydy, które działają statycznie lub bójczo na bakterie i grzyby. Na powierzchnię owoców drobnoustroje są przenoszone przez powietrze lub owady. Zanieczyszczenie mikrobiologiczne owoców następuje podczas ich bezpośredniego kontaktu z podłożem (trawą, glebą) w czasie zbiorów. Na owocach oprócz drożdży z rodzaju : Saccharomyces, Candida, Pichia, Cryptococcus oraz pleśni: Penicillium, Mucor, Rhizopus występują bakterie z rodzajów Micrococcus i Bacillus oraz pałeczki grupy coli. Większość szczepów drożdży charakteryzuje się właściwościami fermentacyjnymi, powodując spontaniczną fermentację soków i moszczy. W czasie przechowywania owoców rozwój przeważającej mikroflory bakteryjnej jest ograniczony przez niskie pH. Istnieje jednak duże niebezpieczeństwo namnażania się drobnoustrojów acidofilnych. Szczególnie niebezpieczne są bakterie przetrwalnikujące z rodzaju Alicylobacillus, występujące powszechnie w surowcu i mogące stanowić zagrożenie dla pasteryzowanych przetworów. Mikroflora warzyw jest zależna od ich rodzaju. Na warzywach zielonych (sałata, kapusta, szpinak) występują głównie bakterie fermentacji mlekowej oraz drożdże i pleśnie. Warzywa korzeniowe i bulwiaste są znacznie silniej skażone niż inne. Dominują bakterie z rodzaju: Bacillus, Clostridium, Micrococcus, Flavobacterium. Przy intensywnym nawożeniu mikroflorę stanowią jeszcze saprofityczne bakterir pochodzenia jelitowego oraz bakterie chorobotwórcze Listeria monocytogenes, Yesinia enterocolitica i patogenne szczepy E. coli.
Mięso
Głównym składnikiem mięsa są woda, białko i lipidy. Znaczna zawartość substancji białkowych w mięsie i zbliżona do obojętnego wartość pH 6, sprzyja rozwojowi różnych mikroorganizmów, zarówno w warunkach tlenowych, jak i beztlenowych. Mięso świeże ma wyraźną choć przemijającą naturalną oporność ograniczającą rozwój drobnoustrojów. Oporność ta wynika przede wszystkim z zachowania przez pewien czas przyżyciowej struktury białek mięsa, niewrażliwej na działanie enzymów bakteryjnych. Nieprawidłowo przeprowadzony ubój oraz dalsze zabiegi technologiczne mogą się stać przyczyną silnego zanieczyszczenia mięsa. Często źródłem zanieczyszczenia są pracownicy rzeźni, nosiciele różnego rodzaju bakterii. Nosicielami mikroorganizmów są także owady i gryzonie . Na powierzchni mięsa występują najczęściej bakterie z rodzaju: Pseudomonas, Bacillus, proteusz oraz pleśnie należące do rodzajów Mucom i Rhizopus. Stopień namnażania drobnoustrojów w mięsie zależy od początkowegozanieczyszczenia, temperatury, pH, zawartości wody na powierzchni oraz wilgotności powietrza. Szybkość penetracji bakterii w głąb tkanki mięśniowej zależy od temperatury środowiska. Większość organizmów mogących powodowąć niekorzystne zmiany mięsa należy d organizmów mezofilnych (20-40C). W czasie przechowywania mięsa w warunkach chłodniczych dominują bakterie psychrofilne i psychrotrofowe głównie paleczki z rodzajów Pseudomonas oraz Moraxella. Bakterie te tworzą charakterystyczny śluz, który pojawia się po kilku dniach przechowywania. Mięso produkty mięsne mogą być również zanieczyszczone przez drobnoustroje patogenne: Salmonella, Yersinia, Clostridium botulinum.
Surowce pochodzenia roślinnego (jabłko, marchew, ziemniak) i zwierzęcego (mięso). Badane surowce po rozdrobnieniu zalano sokiem własnym i rozlano do sterylnych probówek. Jedną próbkę każdego surowca pozostawiono w stanie surowym, a pozostałe poddano następującym zabiegom termicznego utrwalania: pasteryzacji (85C, 10 minut) i sterylizacji (121C, 20 minut). Następnie wszystkie surowce inkubowano w temperaturze pokojowej przez 7 dni.
Jabłko
Marchew
Ziemniak
W przypadku jabłka, które ma kwaśne środowisko pasteryzacja jest wystarczającą metodą utrwalania (niskie pH dodatkowo zabezpiecza surowiec przed rozwojem mikroflory). W przypadku marchewki możemy ja utrwalać obniżając pH lub przy pomocy pasteryzacji lub tyndalizacji po zakwszeniu . Ziemniak może być utrwalony przy pomocy tyndalizacji i suszenia. Mięso można mrozić, sterylizować, suszyć, wędzić, peklować, tyndalizować, zaoctować, zakwasić, solić.
Przemiany:
· fermentacja octowa- silne zakwaszenie środowiska, zapach kwasu octowego, w preparacie stwierdza się obecność pałeczek
· Fermentacja mlekowa- zakwaszenie środowiska, kwaśny zapach, w preparacie stwierdza się obecność pałeczek (głównie w środowiskach roślinnych) i paciorkowców
· Fermentacja masłowa- nieznaczne zakwaszenie środowiska, gazowanie, ostry zapach kwasu masłowego, w preparacie pobranym z dna próby stwierdza się obecność ruchliwych laseczek
· Fermentacja alkoholowa- gazowanie, zapach alkoholu, w preparacie stwierdza się obecność drożdży
· Proteoliza- alkalizacja środowiska, ostry zapach amoniaku, w preparacie stwierdza się obecność ruchliwych laseczek i pałeczek
Charakter mikroflory będzie zależał od składu surowca, pH. We wszystkich probówkach możemy zaobserwować zjawisko zwane komensalizmem oraz metabiozą ( przez pierwszy okres dominuja drobnoustroje które metabolizują dany związek, a w drugim etapie pojawi się mikroflora, która zasubstrat będzie stosowała związek będący produktem metabolizmu pierwszej npjabłko surowiec roślinny, niskie pH, dużo cukrów prostych. Drożdże metabolizują cukry do alkoholu, a następnie pojawiają się bakterie octowe, które metabolizują alkohol do kwasu octowego.
3. Diagnostyka drobnoustrojów stosowanych w procesach biotechnologicznych i występujących w środowiskach naturalnych: metody klasyczne identyfikacji bakterii i drożdży (stosowane pożywki, wykonanie analiz, interpretacja wyników). Identyfikacja mikroorganizmów z wykorzystaniem testów API.
Bakterie:
I. Badanie cech hodowlanych i morfologicznych
a) posiew na pożywki płynne i obserwacja makroskopowych cech wzrostu (obecność osadu, zmętnienia, błonki na powierzchni). Stosowana pożywka to bulion , pozywka APL lub MRS
b) posiew na pożywki stałe (skos) i ocena makroskopowych cech wzrostu (zwrócić uwagę na zabarwienie biomasy)
c) z pożywek płynnych wykonać bezpośrednie preparaty ...
ewastyna1