1.3.pdf

(252 KB) Pobierz
Syntonia – można porównywać ułożenia genów między dwoma mikroorganizmami i w ten sposób
można dowiedzieć się gdzie występują ich dodatkowe zespoły genów tzw. wyspy patogenności czy
też inne wyspy kodujące np. oporność na antybiotyki lub metabolity drugorzędowe. Można również
wykryć różne inwersje, oraz przewidzieć jak genomy mikroorganizmów patogennych ewoluowały.
Genomy bakterii dostosowując się do danego gospodarza traciły geny zaangażowane w metabolizm
pierwszorzędowy. Mogą występować też przypadki w których bakterie (np. Mycoplazma) nie kodują
ATP i pobierają go od gospodarza oddając ADP na wymianę na ATP.
Nocardia – z rodzaju promieniowce, mogą być patogenami zwierząt i wywoływać tzw. nokardiozę. Są
to bakterie żyjące w glebie, mogą żyć jako bakterie wolnozyjące lub jako patogeny. Ich genom nie jest
zbyt mały, muszą mieć zestawy genów dostosowujące do życia w danym środowisku. Np. do życia w
glebie gdzie jest ubogie środowisko muszą same syntetyzować związki, natomiast jako patogeny
mogą pobierać związki energetyczne od gospodarza. 36% genów to paralogi
Niektóre bakterie podwajają kopię swojego genu i następnie każdy gen specjalizuje się w czyms
innym. Na skutek selekcji środowiskowej dochodzi do mutacji jednego genu i gen ten specjalizuje się
dzięki czemu mikroorganizm nabywa jakiś nowych cech umożliwiających przebywanie w danym
środowisku.
Propionibacterium Agnes – odpowiedzialna za występowanie trądziku, powoduje stany zapalne
mieszków włosowych/łojowych. Jest bakterią patogenną. Wykorzystywana jest w przemyśle
mleczarskim – nadaje smak orzechowy serom typu ementaler gdyż syntetyzuje kwasy propionowe.
Genom mniejszy niż genom Nocardi ponieważ nie jest w stanie żyć w formie wolnożyjącej w
środowisku.
Streptomyces – bakteria glebowa, złożony cykl życiowy, chromosom w formie liniowej, przypominają
grzyby. Genom bardzo duży, w środku znajduje się region replikacji oriC, rdzeń genomu stanowią
geny metabolizmu pierwszorzędowego, natomiast na ramionach genomu występują geny
metabolizmu drugorzędowego syntetyzujące antybiotyki. W warunkach laboratoryjnych geny odp. za
biosyntezę antybiotyków nie ulęgają ekspresji dlatego stosując metody inżynierii genetycznej (np.
wprowadzenie silnego promotora) można zwiększyć ekspresję danych genów. Wokół regionu oriC
zlokalizowane są najważniejsze geny ponieważ z warunkach niesprzyjających (zmiennych) w
pierwszym rzędzie replikacji ulegają te geny które znajdują się najbliżej regionu oriC.
Im większy genom mikroorganizmu tym większa zawartość %GC.
Pozyskiwanie nowych genów(cech):
Mikroorganizmy mogą pozyskiwać geny w wyniku transferu horyzontalnego np. w przypadku
patogenów mogą pobierać geny umożliwiające im przeżycie w danym gospodarzu.
Mogą występować rearanżacje genów
Duplikacja genów – powstawanie paralogów
U mikroorganizmów mogą powstawać pseudogeny które z czasem ulęgają delecji.
Ważne jest aby móc obserwowac i kontrolować bakterie występujące w danej próbce. Niestety
większość komórek bakteryjnych nie jesteśmy w stanie hodować w warunkach laboratoryjnych.
Dzięki zastosowaniu różnych metod detekcji można wyznakować bakterie w danej próbce. Jedną z
takich technik jest metoda FISH (fluorescencyjna hybrydyzacja in situ). W metodzie tej za pomocą
sondy fluorescencyjnej można wizualizować bakterie bezpośrednio w ich środowisku bytowania, np.
w wodzie lub tkance człowieka. Dzięki zastosowaniu sond można lokalizować określone białko lub
lokalizować bakterie w mieszanych populacjach. Ważne jest dobranie dobrego fluorofora czyli taki
który ma:
Dobre właściwości spektralne
wysoka absorpcja światła (wysoki współczynnik ekstynkcji)
wysoka wydajność kwantowa
niska fotodestrukcja
małe rozmiary / łatwość doczepienia do biomolekuły np. cząsteczki białka
Najczęściej wykorzystywany fluorofort z technice FISH to znakowany fluorescencyjnie
oligonukleotydy.
W mikrobiologii metoda FISH wykorzystywana jest w analizach mikroskopowych. Materiał
genetyczny to najczęściej chromosomalne DNA czasami może być plazmidowe DNA. Materiał
genetyczny należy denaturować aby był w postaci jednoniciowego DNA tak by sonda homologiczna
do danego fragmentu DNA mogła się związać.
Sondy do FISH powinny być krótkie ok 20pz ale nie za krótkie gdyż będą się wiązać niespecyficznie ale
tez nie mogą być za długie gdyż kinetyka hybrydyzacji będzie niska. Sondy musza zawierać znacznik
fluorescencyjny przy końcu 3’.
Do określania mikroorganizmów stosuje się najczęściej markery filogenetyczne czyli np. 16/23 S rRNA
lub rDNA. Jeżeli chcemy określić wszystkie bakterie znajdujące się w badanej próbce należy wybrać
taki region/sekwencję 16 S rRNA który jest konserwatywny i występuje u wszystkich
mikroorganizmów. Natomiast jeżeli chcemy dokonać detekcji określonego rodzaju bakterii to należy
wybrać region zmienny 16 S rRNA który występuje u tej a nie innej bakterii.
Sondy wykorzystywane w metodzie FISH: Sybr Green, TaqMan, molecular Bacon
Wiązanie biotyna-streptawidyna jest jednym z najsilniejszych wiązań występujących w przyrodzie.
Jak wykonujemy technikę FISH:
sekwencja docelową nie jest chromosomalne DNA lecz rybosomalne
najpierw trzeba bakterie przygotować tak aby sondy mogły wniknąć do ich środka, błona
komórkowa musi być przepuszczalna dla sondy (permeabilizacja błony)
komórki muszą być utrwalone za pomocą etanolu lub metanolu
ważne są inhibitory RNaz – RNA łatwo degraduje
komórki Gram+ nadtrawiane są lizozymem
DNA/RNA docelowe musi być w formie jednoniciowej aby sonda mogła się związać dlatego w
tym celu stosowany jest formamid (stężenie formamidu większe jeżeli duża zawartość %GC),
formamid osłabia wiązania wodorowe
Przemywanie solą w celu pozbycia się niezwiązanej sondy
Detekcja pod mikroskopem lub za pomocą fluorymetrii przepływowej(do zliczania komórek)
Zalety FISH:
-nie trzeba hodować bakterii
-szybka detekcja – kilka godzin
-można badać zależności między bakteriami
-nie trzeba oczyszczać DNA ani go amplifikować
Wady FISH:
-duże tło – autofluorescencja
-w przypadku bakterii o których nic nie wiemy nie wiadomo jak je potraktować aby sondy wniknęły
do środka komórki
-niksi poziom RNA – degradacja RNA
Gąbki morskie – naturalne filtry wody morskiej- za pomocą FISH można identyfikować wiele różnych
bakterii
W hodowlach linii komórkowej detekcja chlamydii za pomocą FISH
Zastosowanie FISH: w medycynie, diagnostyce, mikrobiologii lekarskiej, detekcja patogenów we krwi,
w plwocinach
Modyfikacje FISH:
Pseudopeptydowe sondy
Mikroautoradiografia
Mikroautoradiografia- stwierdzenie czy bakterie z danych warunkach żyją czy żyły, dodaje się do
mieszaniny hybrydyzacyjnej FISH znakowane prekursory które inkorporowane są do struktur
komórkowych bakterii. Jeżeli bakterie są żywe – metabolizują i zaczerniają kliszę. Dzięki tej metodzie
można określić czy w probówkach z lodowców są bakterie i czy można je ożywić.
Prekursorowe rRNA: podjednostki(16, 23 i 5 S) kodowane są w operonie pod wspólnym promotorem,
zachodzi transkrypcja i powstaje jeden długi transkrypt w którym podjednostki rRNA nie są jeszcze
rozdzielone. Transkypt ten ma krótki czas życia i poddawany jest obróbce w wyniku której powstają 3
oddzielne podjednostki tj: 16, 23 i 5 S rRNA. Wyznakowanie za pomocą sondy długiego transkryptu
jeszcze przed obróbką pozwala na zidentyfikowanie czy bakterie są żywe.
Sondy pseudopeptydowe PNA - Sondy PNA to cząsteczki kwasu peptydonukleinowego, które
naśladują cząsteczkę DNA, jedyna różnica polega na zastąpieniu ujemnie naładowanego szkieletu
fosforanowo-cukrowego obojętnym elektrycznie fragmentem poliamidowym lub peptydowym.
Odstepy między takimi peptydonukleotydami muszą być takie same jak między normlanymi
nukleotydami. Sondy te są bardzo trwałe, nie są wrażliwe na Endo- i egzonukleazy, sondy te są
swoiste, wykazują szybką kinetykę hybrydyzacji.

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika:

Zgłoś jeśli naruszono regulamin