metagenom3.pdf

(409 KB) Pobierz
Wykład 3
- jeśli poszukujemy szlaku metabolicznego, w którym powstaje jakiś nowy lek
przeciwnowotworowy lub antybiotyk to musimy mieć większy nośnik tej informacji np.
kosmid lub mini chromosomy.
- przepis „kuchenny” by wiedzieć jak się izoluje z wody i konstruuje bibliotekę genów.
Wielkość fragmentów wskazuje na to, ze szukamy raczej genu a nie zespołu genów.
- The Economist jest ekstra. Dostrzegło duży potencjał w metagenomice, szukaniu milczących
sekwencji/genów.
- Schemat tego co można uzyskać przy szukaniu tych genów.
- Schemat tworzenia takich bibliotek. Najprostszym sposobem jest poszukiwanie
fragmentów DNA, w których zawarte geny syntezy antybiotyków. DNA środowiskowe
mechanicznie podzielić na mniejsze odcinki, potem sklonować np. do kosmitów i stworzyć
tzw. bibliotekę genomową, stranformować E coli taką biblioteką a potem wysiać na płytkę i
obserwować strefy zahamowania wzrostu przy konkretnych antybiotykach. Jeżeli szukamy
produktów ekspresji genu to tego etapu klonowania nie można ominąć.
- Te doświadczenia pokazały co można wykryć analizując sekwencje tych bibliotek z
environment al DNA np. odkrycie tego, że bakterie mają białka typowo eukariotyczne np.
rodopsyny. Taka rozmaitość tych genów produkujących różne homologi może przyczynić się,
że z puli tych białek można wybrać takie najbardziej optymalne i potem użyć do produkcji
energii świetlnej.
- Teraz pytanie krótkie choć w sumie nie tak krótkie ale odpowiedź krótka. Ile wystarczy
genów by bakteria mogła w labie się replikować? Jeśli to jest minimalny zestaw genów
można wstawić dowolnie inny duży kawałek i zaprogramować by bakteria produkowała coś
co chcemy uzyskać. Bakterią która ma najmniejszy genom to Mycoplasma genitalium. Ta
bakteria ma koło 500 genów. Okazało się, że każdy gen albo ulegał delecji albo za pomocą
transpozonów przerywano gen, więc przestawał być funkcjonalny, co robiono z każdym
genem. Jest to sposób zautomatyzowany. Okazało się, ze spośród tych 500, 350 jest
niezbędnych do życia w warunkach laboratoryjnych. Czy ta liczba genów była by
wystarczająca do bytowania bakterii w naszym organizmie? Trudno powiedzieć, bo może
potrzebuje wiecej lub mniej tych genów. Czyli odpowiedź: tak można, minimalny zestaw to
niewiele ponad 300 genów.
- czy można stworzyć sztuczną bakterię? Ten koleś o którym mówi ciągle. Wziął dwie
mycoplasmy , capricolum i mycoides i z jednego gatunku wyciągnał cały chromosom za
pomocą mikromanipulatora i wsadził do tego samego gatunku chromosom z innego gatunku.
Zrobił taki zabieg , że do DNA z innego gatunku bakterii, który wprowadzał do tej wydmuszki
wprowadził gen reporterowy, który powodował, że kolonie barwiły się na niebiesko. On
pokazał, że można przenieść chromosom z jednej bakterii do drugiej i ona będzie się
namnażać z cechami tej bakterii od której pochodził chromosom. Stworzył Mycobacterium
laboratorium.
- Wyjaśniła co będziemy robić na ćwiczeniach.
- Teraz znowu o genomice. Jeśli izolujemy DNA ze środowiska i później sekwencjonujemy to
bardzo trudno byłoby zrobić alignment i ułożyc sekwencje każdego z chromosomów z
róznych szczepów.
- jakie wnioski można wyciągnąć z analizy sekwencji genomów? Jeśli chodzi o patogeny to
można szukać określone cechy. Projektów sekwencjonowania genomów bakteryjnych teraz
jest około 20 tysięcy. Ciekawostka z rodzimego ogródka: Polska bierze w niewielu projektach
sekwencjonowania. Polska uczestniczy w procesie sekwencjonowania ziemniaka. Zanim się
zanalizuje sekwencje genomu bakteryjnego to trzeba stwierdzić w jakiej formie występuje.
Czy liniowy, czy kołowy, czy mają więcej niż jeden chromosom, bo mogą mieć nawet 3. Np.
Agrobacterium ma 2, jeden liniowy a drugi koliście zamknięty. Gdybyśmy chcieli nałożyć na
siebie wszystkie fragmenty DNA w trakcie sekwencjonowania i odtworzyć cały zapis
chromosomu to oczywiście w przypadku chromosomu kolistego zawsze znajdziemy
nakładające się wszędzie odcinki ulegające sekwencjonowaniu a w przypadku liniowego to
pewnie takich odcinków nie znajdziemy. Długość genomu to pół miliona pz do co najmniej
kilkunastu milionów.
- Drożdże przykładem organizmu które mają mniej genów niż bakterie Streptomyces.
- Charakterystyczne cechy chromosomów bakteryjnych: duże zróżnicowanie w zawartości
par GC. Nawet do ponad 70%. Co to oznacza jeśli chodzi o kod genetyczny? W 3 pozycji kod
genetyczny jest najbardziej zdegenerowany. Kodonów mamy 64, więc jeden aminokwas jest
kodowany przez kilka kodonów, prawie zawsze. Różnica w procencie GC między
mikroorganizmami biorąc pod uwagę kod genetyczny to można się domyślić, że w pozycji 3
najczęściej będą nukleotydy G lub C. Dlatego mikroorganizmy mają codone usage czyli jest
pula kodonów częściej „używanych” z parami GC i tych mniej.
- Co dostarcza nam informacja organizacji materiału genetycznego u bakterii? Można wziąć
na przykład Vibrio cholerae. Jest to ciekawa bakteria bo ma 2 koliście zamknięte
chromosomy, jeden duży, 4 mln par zasad, a drugi mały ponad milion par zasad. I TERAZ TAK,
analiza genów na obu chromosomach wskazuje że duży chromosom ma house keeping
genes. Czyli te niezbędne geny związane z metabolizmem pierwszorzędowym, replikacją,
translacją itp. Natomiast ten drugi chromosom zawierał takie geny, które tylko w pewnych
okolicznościach pozwalają tej bakterii przeżyć, w pewnych warunkach. Co śmieszne!
Mechanizm replikacji dużego jest taki typowo bakteryjny a tego małego przypomina bardziej
plazmid. Więc czy jest to plazmid czy chromosom? Jest to chromosom bo są tam geny, które
pozwolą przeżyć bakterii w pewnych warunkach. Ta bakteria może sobie żyć w wodzie a po
dostaniu się do człowieka intensywnie się będzie replikować. Dlatego czy podział
chromosomu na takie dwie części? Wydaje się , że ma. Bo np. replikacja kolistego
chromosomu zaczyna się w jednym miejscu, potem w dwie strony idzie i spotyka się na
końcu (terminacja) Wiec jeśli materiał rozłożony na 2 chromosomy to gdy bakteria napotka
dobre warunki do rozwoju to szybciej zreplikuje 2 mniejsze chromosomy niż 1 duży.
- Najprostszą analizą genomów bakteryjnych są wykresy gdzie pokazuje się wielkość genomu
względem ilości ORFów. Bakterie mają bardzo upakowaną informacje genetyczną. Większość
stanowią geny, nie ma za bardzo przerw. Wielkość genomu jest wprost proporcjonalna do
ilości ORFów najczęściej. Patogeny mają najczęściej mało genów i mniejsze genomy.
Dlaczego? Patogenne bakterie żyjące w organizmie gospodarza korzystają z zasobów jego
energii i innych produktów, więc po prostu nie muszą same od początku wielu rzeczy
produkować. Więc w toku ewolucji pewne geny zostały wyeliminowane. Im bardziej patogen
uzależniony od gospodarza , np. patogeny obligatoryjne tym mniej ma genów. Niektóre
nawet nie produkują ATP i biorą od gospodarza oddając ADP. Małe genomy mają też
endosymbionty. Przykład dwóch chorobotwórczych bakterii: P. aeruginosa, H. influanzae.
Procentowa zawartość GC i ilość ORFów. Porównanie jakie geny SA zaangażowane w jakie
rzeczy u tych dwóch bakterii. Myślę, że mało ważne. Geny odpowiedzialne za translacje to
jest ich po równo u jednej i drugiej a bardziej zróżnicowana liczba genów do replikacji,
rekombinacji i naprawy. Bakterie wewnątrzkomórkowe nie muszą produkować wszystkich
aminokwasów bo sobie wezmą od gospodarza więc genów odpowiedzialnych za syntezę
aminokwasów jest znacznie mniej. Dlaczego liczba genów do transkrypcji jest różna u tych
bakterii? Ano dlatego, że polimeraza RNA składa się z czynników sigma rozpoznających
region promotorowy wiec polimeraza się dobrze przyłączy. I tych podjednostek może być
bardzo dużo, w zależności od sygnałów środowiskowych jest inny zestaw genów
uruchamiany bo różne czynniki rozpoznają różne regiony promotorowe uruchamiając
ekspresję różnych genów na różne okoliczności. (naprawdę powiedziała tyle razy ’różne’).
- W genomie ludzkim jest mało genów a większość to sekwencje powtórzone lub
niekodujące (co wynika z naszej niewiedzy dotyczącej sposobu ekspresji , regulacji komórek
eukariotycznych) ale przyroda nie jest rozrzutna więc te sekwencje pewnie maja jakieś
zadanie.
-Dobrą metodą analizy ułożenia genów jest tzw. analiza syntonii. Jak to się robi? Mamy
punkt odniesienia na chromosomie bakteryjnym, mamy region oriC gdzie zaczyna się
replikacja i analizujemy położenie genów u mikroorganizmu A z położeniem genów u
mikroorganizmu B. Jeżeli geny na chromosomie np. gen kodujący helikazę DnaB występuję
zaraz za regionem ori w dwóch miejscach to jest zgodność ułożenia. Jeśli geny w sposób
identyczny ułożony to otrzymamy linię prostą. Jeśli natomiast gen znajdujący się w jednej
pozycji w org A znajduje się w innej pozycji org B to będzie inaczej xd Ona tam sobie rysuje
na tablicy więc ciężko to tutaj opisać a w jej świetnym wyciągu nie ma tych wykresów.
- Występują na genomie tzw. wyspy patogenności i tam są zlokalizowane geny, które kodują
jakieś toksyny czy cytotoksyny bakteryjne. Powodują, że bakteria stanie się chorobotwórcza.
- To co wokół regionu oriC jest ważne bo to jakby siły wczesnego reagowania, tu już może
być transkrypcja i translacja z obydwu kopii po replikacji.
- Analizując inne mikroorganizmy można dojśc do wniosku, że całe ogromne bloki genów
mają całkowicie inne położenie na chromosomie.
ORTOLOG
– To ten sam gen ale występujący u różnych gatunków o wspólnym przodku. Np.
gen u człowieka i szympansa.
PARALOG
– jeden wspólny przodek danego jednego organizmu ale zwielokrotniony
zduplikowane kopie genu (tego samego) np. geny rRNA. One są zorganizowane w operony,
jest region promotorowy 16S, 23S i 5S. Takich operonów może być od 1 (M. tuberculosis) do
7-8 (E. coli). One głównie są zlokalizowane w regionie oriC i w momencie gdy bakteria
przechodzi do warunków idealnych do życia i jest wzmożone zapotrzebowanie na syntezę
białek do replikacji i podzielenie w dogodnych warunkach to te 7 operonów jej to zapewnią.
PROMIENIOWCE:
Dlaczego wybrała promieniowce? Bo to bardzo zróżnicowana grupa Gram+ bakterii pod
względem wielkości genomu (1-10 mln pz) oraz formy w jakiej występują (liniowa/kolista) a
także liczby operonów rRNA (1-7) i średniej zawartości procentowej GC. Styl życia tych
bakterii też jest zróżnicowany bo i patogeny wewnątrzkomórkowe i wolnożyjące. Obecnie
jest znanych kilka tysięcy projektów sekwencjonowania genomu promieniowców. W skład
tych promieniowców wchodzą Streptomyces, Bifidobacterium a także Mycobacterium.
- Streptomyces mają liniowy chromosom i w części centralnej są zlokalizowane geny
zaangażowane w metabolizm pierwszorzędowy (house keeping genes) a końce ramion tego
chromosomu są bardziej zmienne (metabolizm drugorzędowy, np. synteza antybiotyków).
Używa się teraz 16S rRNA by konstruować drzewa filogenetyczne.
INNI PRZEDSTAWICIELE:
-
Bifidobacterium
- bakterie pro biotyczne, przemysł mleczarski, ścisłe beztlenowce
(Bifidobacterium laudum, komensal żyjący w jelicie, 34% genów ma homologie do
Streptomyces coelicolor). Te bakterie są probiotykami, hamują wzrost niekorzystnych
mikroorganizmów takich jak E. coli czy Candida albicans. Analizy metagenomiczne pokazują,
że równowaga między tymi „dobrymi” mikroorganizmami a złymi jest bardzo zachwiana.
-
Corynebacterium
– maczugowce, dwa rodzaje glutamicum (bardzo pożyteczne dla
człowieka) wykorzystywane do produkcji określonych rodzajów aminokwasów, głównie
kwasu glutaminowego a znajomość genomu pozwala na jego modyfikacje, które zmuszą ją
do wzmożonej produkcji tego kwasu. Drugi rodzaj: , %GC jest różny od tego pierwszego.
Codone usage pokazuje że te organizmy używają innych kodonów niż ten drugi rodzaj. Nie
wszystkie są dobre, niektóre złe które wywołują dyfteryt. Dzieci po prostu się dusiły chyba,
że się szczypce w gardło włożyło. Genom tej bakterii jest sporo mniejszy od tych dobrych
maczugowców. Część niepotrzebnych genów została utracona na drodze ewolucji. Ma wyspy
patogenności które produkują toksynę.
- Co oznacza, że nagle poziom GC spada? To znaczy, ze to kawałek DNA, który w wyniku
transferu horyzontalnego został przejęty od innej bakterii , której skład GC był odpowiednio
niższy.
- patogen trzciny cukrowej, ma bardzo mały genom, 4x mniejszy od Strepto. Analizując jego
genom stwierdzono, że mała liczba genów i stwierdzono dużą liczbę pseudogenów (nie
ulegające ekspresji). Ten gatunek promieniowca przyłapaliśmy na etap ewolucji, w którym on
się dopasowuje do swojego gospodarza. Odkryto tam geny odpowiedzialne za degradacje
ksylemu i tkanek roślinnych.
-
Mycobacterium tuberculosis
– w przeciwieństwie do Streptomyces, nie produkują
zarodników i nie rosną w postaci grzybni. Wielkość genomu to ok 4 mln pz. Szczepem
modelowym w badaniach w laboratium to Mycobacterium smegmatis. Wolnorosnąca a jej
genom ma długość 7 mln pz. Tuberculosis żyje wewnątrzkomórkowo. Też utraciły geny
niepotrzebne w trakcie ewolucji. Mycobacterium leprae – genów jeszcze mniej niż u
tuberculosis, niesłychanie duża liczba pseudogenów.
DLACZEGO ZDJĘCIE PANCERNIKA?
xd bo te bakterie bardzo wolno rosną, dzielą się co 14 dni,
nie da się ich hodować w warunkach laboratoryjnych i jeśli byśmy chcieli namnożyć ten
organizm by uzyskać wystarczającą liczbę DNA to jedynie można hodować je na pancerniku.

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika:

Zgłoś jeśli naruszono regulamin