vol5222013185.pdf

(268 KB) Pobierz

POST. MIKROBIOL.,

2013, 52, 2, 185–200

http://www.pm.microbiology.pl

METAGENOM ŹRÓDŁO NOWEJ INFORMACJI

O MIKROORGANIZMACH GLEBOWYCH

Jacek Kozdrój

Katedra Mikrobiologii, Uniwersytet Rolniczy im. Hugona Kołłątaja, al. Mickiewicza 24/28, 30-052 Kraków

Wpłynęło w lutym 2013 r.

1. Wstęp. 2. Problemy z poznaniem mikrobiomu oraz próby ich przezwyciężania. 3. Metagenomika a specyficzny charakter gleby.

4. Analiza genetyczna mikrobiomu. 5. Analiza funkcjonalna metagenomu. 6. Strukturalna różnorodność mikroorganizmów w różnych

środowiskach glebowych. 7. Podsumowanie

Metagenome – a new source of information about soil microorganisms

Abstract:

Soil environment, due to its high heterogeneity, is considered as a major reservoir of microbial genetic and metabolic diversity

in the biosphere. e knowledge on this diversity is limited, because most of the soil microorganisms cannot be cultured under the usual

laboratory conditions. During the last two decades, development of methods to isolate nucleic acids from soil has opened a window to

a previously unknown microbial world. In consequence, a new metagenomic approach based on the analyses of total microbial DNA has

appeared in soil studies. Total microbial DNA extracted from soil by direct or indirect methods is mostly used for amplification of marker

genes (e.g. SSU rRNA) which is further di erentiated by fingerprinting (e.g. DGGE, T-RFLP) or sequenced directly. Until recently,

sequencing was mainly performed a er first cloning PCR products to produce a clone library of amplicons. Lately, another approach has

been introduced to reduce costs and labour; it is commonly known as 454-pyrosequencing, the method that does not require cloning.

ese methods as well as DNA microarrays have demonstrated an unanticipated level of microbial diversity, especially in the newly

discovered world of the biosphere. ousands or even several hundred thousands of di erent bacterial phylotypes can be present in

a gram of soil. ey belong to dozens of phyla. e molecular approach changed the picture of structural diversity of soil microbiome,

also indicating that bacteria, archaea, fungi and even viruses are diverse both globally and locally. Moreover, soil metagenomics, allows

for a comprehensive search for gene expression and metabolic activity within microbiome.

1. Introduction. 2. Difficulties with microbiome analysis and attempts to overcome them. 3. Metagenomics vs. distict features of soil.

4. Genetic analysis of microbiome. 5. Functional analysis of microbiome. 6. Microbial structural diversity in di erent soil environments.

7. Summary

Słowa kluczowe:

bioróżnorodność, metagenomika, mikrobiom glebowy

Key words:

biodiversity, metagenomics, soil microbiome

1. Wstęp

Mikroorganizmy stanowią najbardziej istotną a jedno-

cześnie zróżnicowaną grupę organizmów wchodzących

w skład biosfery ziemskiej [93]. Większość bioróżno-

rodności, spotykana w obrębie trzech domen: bakterii,

archeonów oraz eukariotów, jest reprezentowana przez

mikroorganizmy [97], które szeroko rozprzestrzeniły

się we wszystkich typach środowisk, nawet tych ekstre-

malnych, w ciągu blisko czterech miliardów lat swojej

ewolucji. Tak długi czas umożliwił wykształcenie się

najróżnorodniejszych mechanizmów metabolicznych,

które pozwoliły im zaadaptować się do prawie każdej

możliwej niszy ekologicznej i wykorzystać do swego

rozwoju różnorodne warunki środowiskowe [59].

Środowisko glebowe jest uważane za najbogatszy

rezerwuar różnorodnych mikroorganizmów [90], co nie

jest trudne do zaakceptowania, zważywszy na wysoce

heterogeniczny charakter warunków fizykochemicznych

panujących w tym środowisku, a także uwzględniając

zróżnicowanie typów gleb powstałych na Ziemi. Jedno-

cześnie, specyficzny charakter gleby powoduje, że jest

ona traktowana jak swego rodzaju „czarna skrzynka”:

pod względem składu mikrobiomu, aktywności i proce-

sów przeprowadzanych przez występujące w niej mikro-

organizmy. Nie jest pozbawiona racji myśl sformuło-

wana przez L e o n a r d o d a V i n c i już w 1510 roku,

że być może więcej wiemy o ruchach ciał astralnych, ani-

żeli o tym, co dzieje się w ziemi pod naszymi stopami.

Kilka wieków później równie sceptyczny był S e l m a n

W a k s m a n, który w 1925 roku stwierdził, że: „ brak

jest stosownych metod w badaniach mikrobiologicznych

gleby, a te z metod stosowanych obecnie są dalekie od

tego, aby w adekwatny sposób dać nam wiedzę o tym,

co rzeczywiście dzieje się w glebie” [46]. Co ciekawe,

ten sam mikrobiolog w 1931 roku sformułował prze-

ciwną opinię, że: „zgromadzona już olbrzymia baza

informacji pozwala przedstawić jasny obraz mikrosko-

powej populacji mikroorganizmów glebowych” [32].

Tak diametralnie odmienne opinie mogą budzić zdzi-

wienie i pytanie o stabilność naukową kryteriów badań

mikrobiologicznych. Zgodnie z ustaleniem przyjętym

* Autor korespondencyjny: Katedra Mikrobiologii, Uniwersytet Rolniczy im. Hugona Kołłątaja, al. Mickiewicza 24/28, 30-052 Kraków;

tel.: 12 662 40 96; e-mail: j.kozdroj@ur.krakow.pl

186

JACEK KOZDRÓJ

w 1923 roku przez

Bergey’s Manual,

podstawą identy-

fikacji nowego gatunku mikroorganizmu jest koniecz-

ność sklasyfikowania jego szeregu cech morfologicz-

nych, biochemicznych, fizjologicznych i genetycznych

po wcześniejszym jego wyhodowaniu na odpowiednim

podłożu [32]. Jak wielkie stanowi to wyzwanie, niech

świadczy fakt znajomości tylko ponad 9000 gatunków

bakterii, wobec potencjalnych 10

–10

różnych drobno-

ustrojów występujących w gramie gleby [27]. Ta roz-

bieżność między liczbą mikroorganizmów dających się

wyhodować, a tymi, o istnieniu których świadczą wyniki

analiz mikroskopowych i molekularnych, jest powodem

ustawicznej frustracji mikrobiologów.

2. Problemy z poznaniem mikrobiomu oraz próby

ich przezwyciężania

Przez blisko sto lat rozwoju mikrobiologii zdoby-

wana wiedza o świecie mikroorganizmów dotyczyła

tych, które hodowano na różnych podłożach. Podsta-

wowe właściwości poszczególnych gatunków (szczepów)

tych organizmów określano w oparciu o wyselekcjono-

wane monokultury wyrosłe na podłożu hodowlanym.

To podejście, będące konsekwencją postulatów K o c h a

w badaniach nad drobnoustrojami chorobotwórczymi,

zaważyło na bagatelizowaniu faktu obecności w śro-

dowisku form żywych, których nie można było wyho-

dować. Dominujący model badawczy w mikrobiologii

kazał traktować je jako artefakty, a nie jako istotną grupę

poszerzającą spektrum różnorodności mikroorganiz-

mów, jak postulowali będący w mniejszości zwolen-

nicy istnienia tych organizmów. Swoiste przesilenie,

zmieniające utarte poglądy w mikrobiologii, nastąpiło

w połowie lat osiemdziesiątych ubiegłego wieku, kiedy

oficjalnie potwierdzono istnienie wyraźnej rozbieżności

między liczebnością mikroorganizmów określoną na

podłożu hodowlanym oraz w preparacie mikrosko-

powym, zwaną wielką anomalią liczenia metodą płyt-

kową [78]. Jak się okazało, jedynie 0,1 do 1% bakterii

glebowych może wyrosnąć na tradycyjnych podłożach

hodowlanych w standardowych warunkach laboratoryj-

nych [44, 84]. Innymi słowy, ponad 99% różnorodnych

bakterii w gramie gleby jest poza zasięgiem poznaw-

czym i kryje w sobie rzeszę organizmów o być może

istotnym znaczeniu dla funkcjonowania ekosystemu.

Wśród tego typu mikroorganizmów można wyróż-

nić grupę, którą da się wyhodować na specyficznych

podłożach, spełniających wymogi żywieniowe organi-

zmów, i umożliwiających ich wzrost w odpowiednich

warunkach fizycznych i chemicznych. Drugą grupę

natomiast stanowią mikroorganizmy, których stan

fizjologiczny stanowi przeszkodę dla wzrostu na jakim-

kolwiek podłożu hodowlanym i dlatego są znane tylko

w postaci sekwencji nukleotydowych rRNA (ryboty-

pów), jak np. WS3, OP11, OD1 lub BRC-1. Tutaj należą

też powszechne w glebie mikroorganizmy, występujące

w stadium spoczynkowym o ograniczonej aktywności

komponentów komórkowych warunkujących wzrost

– w przypadku bakterii są to formy drobne (ultra mikro-

bakterie). Te drzemiące formy drobnoustrojów w sprzy-

jających warunkach podlegają wybudzeniu, a więc teo-

retycznie mogą być też wyhodowane na odpowiednim

podłożu. Jednakże są też takie mikroorganizmy glebowe

widoczne pod mikroskopem, które można określić jako

trwale niezdolne do wzrostu (nonviable) o nieodwra-

calnych zmianach komórkowych, lub będące w fazie

zamierania [52].

Manipulacje składem podłoża hodowlanego w kie-

runku obniżenia jego troficzności, dobór odpowiedniego

pH i temperatury, wydłużanie czasu inkubacji, stosowa-

nie polimerowego substratu wzrostowego (np. ksylanu)

oraz żelowych mikrogranul do immobilizacji komórek

izolowanych ze środowiska przed umieszczeniem ich

w podłożu hodowlanym, pozwalają znacząco posze-

rzyć spektrum możliwych do wyhodowania mikroor-

ganizmów glebowych [10, 40, 41, 101]. Wolno rosnące

bakterie glebowe z typów:

Acidobacteria, Chloro exi,

Actinobacteria

(podklasa

Rubrobacteridae), Plancto-

mycetes, Bacteroidetes, Firmicutes

oraz

Proteobacteria,

niewykrywalne według tradycyjnej procedury, mogą

być dostrzeżone w postaci mini kolonii (25–200 µm) po

12 tygodniowej hodowli na podłożu zawierającym ksy-

lan jako substrat pokarmowy oraz gellan (polisacharyd

produkowany przez

Pseudomonas elodea)

jako środek

zestalający zamiast agaru [16]. Ten postęp w metodach

hodowania pospolitych w glebie bakterii, wykrywanych

jedynie na podstawie sekwencji nukleotydowej genu 16S

rRNA, daje nadzieje na uzyskiwanie monokultur tych

organizmów, które wymykały się spod tradycyjnej prak-

tyki laboratoryjnej mikrobiologów. Dzięki temu moż-

liwe jest ich pełne identyfikowanie do gatunku i bliższe

poznanie ich właściwości fizjologicznych i potencjalnie

zajmowanej niszy ekologicznej w glebie.

Przytłaczająca jest jednakże dysproporcja między

liczbą mikroorganizmów możliwych do wyhodowa-

nia, a tymi reprezentowanymi tylko przez fragmenty

genów kwasów rybonukleinowych małej podjednostki

rybosomów (SSU rRNA), które W o e s e i F o x [96]

zaproponowali jako chronometry ewolucyjne organiz-

mów. To odkrycie dało podstawę do sformułowania

paradygmatu biologicznego o podziale świata żywego

na trzy domeny:

Bacteria, Archaea

oraz

Eucarya

[97].

Norman P a c e wraz ze współpracownikami, jako

pierwszy wykorzystał markery komórkowe, geny 5S

oraz 16S rRNA, do charakteryzowania różnorodności

mikroorganizmów prokariotycznych w środowisku

bez potrzeby ich hodowania [60, 77]. Początkowo taka

procedura wymagała bezpośredniego sekwencjonowa-

nia RNA lub jego odwrotnych transkryptów w postaci

METAGENOM ŹRÓDŁO NOWEJ INFORMACJI O MIKROORGANIZMACH GLEBOWYCH

187

kopii DNA (cDNA), co było technicznie kłopotliwe.

Znaczący postęp dokonał się wraz z rozwojem techno-

logii PCR i skonstruowaniem starterów, umożliwiają-

cych amplifikację prawie kompletnego genu rRNA [29].

To zintensyfikowało wykrywanie coraz to nowych tak-

sonów wraz z badaniem różnych biotopów ziemskich

przy użyciu tej nowej techniki [3, 32, 72]. Gromadzone

sekwencje nukleotydowe SSU rRNA w bazie Ribosomal

Database Project (RDP) początkowo w liczbie kilkuset

pozycji, szybko uległy zwielokrotnieniu do 10 tysięcy

w roku 1998, 72 626 w 2003, czy 2 639 157 w grudniu

2012 (RDP-10.31). W tej ostatniej wersji bazy RDP

bakterie są reprezentowane przez 1 186 838 sekwencji

nukleotydowych, natomiast archeony obejmują jedy-

nie 22 615 pozycji. Wśród sklasyfikowanych sekwencji

dominują

Firmicutes

(407 377),

Proteobacteria

(322 871),

Actinobacteria

(176 308) oraz

Bacteroidetes

(135 261).

Rozmiar dysproporcji, między światem mikroorga-

nizmów potencjalnie istniejących, a tymi, które da się

wyhodować, został uwidoczniony po zastosowaniu

metody pomiaru tempa reasocjacji jednoniciowego

DNA, powstałego po denaturacji całkowitego DNA

w wysokiej temperaturze, wyekstrahowanego z mikroor-

ganizmów glebowych [83]. Okazało się, że w gramie róż-

nych gleb może występować od 1000 do 40 000 genomów

mikroorganizmów, co przekracza przeszło 200-krotnie

liczbę organizmów otrzymanych w hodowli [46]. Dal-

sze postępy w analizie reasocjowanego DNA pozwoliły

oszacować różnorodność mikroorganizmów prokario-

tycznych w gramie gleby na poziomie od 500 tysięcy

do 10 milionów genomów [27]. W tym oceanie różnych

genomów identyfikacja do konkretnych taksonów jest

wysoce utrudniona. Jedyną pomocą są bazy sekwencji

nukleotydowych genów SSU rRNA i opracowywane na

ich podstawie znakowane sondy filogenetyczne, które

umożliwiają także ilościowe oznaczenia występowania

różnych taksonów (gatunków), analizując bezpośrednio

próbkę pobraną ze środowiska za pomocą metody uo-

rescencyjnej hybrydyzacji

in situ

[28].

Pomimoznaczącego postępu w badaniach mikro-

organizmów, oraz aby uniknąć konsekwencji jedynie

katalogowania różnorodnych sekwencji nukleotydo-

wych genów SSU rRNA znajdowanych w środowisku,

mikrobiolodzy podjęli się opracowania metod, umożli-

wiających poznanie genetyki, fizjologii i ekologii drob-

noustrojów nie poddających się hodowli.

3. Metagenomika a specyficzny charakter gleby

Pełna charakterystyka organizmów wymaga pozna-

nia sekwencji nukleotydowych ich genomów. Obecnie

w pełni znanych jest 2809 genomów wirusów, 2096 geno-

mów bakterii, 153 genomów archeonów oraz 37 geno-

mów eukariotów (wg IMG/M, Integrated Microbial

Genomes with Microbiome Samples). Liczba ta jest

znikoma, aby wykorzystać ją, jako podstawę do analizy

różnorodności mikroorganizmów w próbce środowisko-

wej, w oparciu o poszukiwanie sekwencji DNA odpowia-

dających znanym genomom. W dodatku taka procedura

byłaby bardzo żmudna, kosztochłonna, i co najważniej-

sze, w niewielkim stopniu uzupełniałaby tradycyjną ana-

lizę mikrobiologiczną. Sytuacja zmienia się, jeśli zamiast

sekwencjonowania poszczególnych genomów, analizie

podda się zbiorczo cały DNA izolowany z próbki śro-

dowiskowej, reprezentujący wszystkie mikroorganizmy.

Ideę analizy zbioru podobnych, ale nie identycznych

jednostek (genomów), stanowiących razem metagenom,

wprowadziła, pod postacią metagenomiki, H a n d e l s -

m a n i wsp. [33], jako sposób na poznanie nieznanych

mikroorganizmów glebowych i ich zdolności syntezy no-

wych produktów (np. antybiotyków). Klasyczna analiza

metagenomiczna jest oparta na: izolacji DNA z próbki

środowiskowej, klonowaniu fragmentów DNA w odpo-

wiednim wektorze, transformowaniu otrzymanych re-

kombinantów do stosownego gospodarza bakteryjnego,

a następnie analizy przesiewowej uzyskanych transfor-

mantów bakterii. Skonstruowana w ten sposób biblioteka

klonów DNA jest dalej analizowana pod kątem zawar-

tości sekwencji nukleotydowych różnych genomów,

wykorzystując filogenetyczne markery (najczęściej gen

16S rRNA), lub ekspresji funkcjonalnych genów kodu-

jących różne enzymy (np. lipazy, amylazy czy proteazy),

genów odpowiedzialnych za biosyntezę nowych anty-

biotyków (np. turbomycyny A i B), albo też DNA klo-

nów poddawane jest losowemu sekwencjonowaniu [32,

14]. Pionierskie prace, oparte na idei klonowania śro-

dowiskowego DNA sformułowanej przez P a c e i wsp.

[60], dotyczyły: (a) analizy społeczności pikoplanktonu

morskiego przy użyciu wektora fagowego [72]; (b) kon-

strukcji pierwszej biblioteki metagenomowej konsorcjum

mikroorganizmów, w tym o aktywności celulolitycznej,

namnożonych na wysuszonej trawie w laboratorium

[35]; (c) konstrukcji pierwszej biblioteki otrzymanej

bezpośrednio ze społeczności prokariotów morskich,

i stwierdzenia w genomach przedstawicieli

Gamma-

proteobacteria

obecności genu kodującego bakterioro-

dopsynę, wcześniej znanego tylko u archeonów [79].

Gleba stanowi szczególne wyzwanie dla analizy meta-

genomicznej. Jest to związane z jej budową strukturalną,

składem chemicznym i niejednolitym rozmieszczeniem

mikroorganizmów, zależnym z kolei od tych pierwszych

czynników. Różnie rozwinięta, w zależności od typu

gleby, struktura agregatowa oparta na składnikach mine-

ralno-organicznych stanowi skomplikowaną mozaikę

mikrobiotopów o zmiennych czasowo i przestrzennie

warunkach fizykochemicznych. W tych mikrobioto-

pach, o rozmiarach od 2 do 20 µm lub mniejszych niż

2 µm, drobnoustroje występują na powierzchni cząstek

piasku lub kompleksów iłowo-organicznych, silnie do

188

JACEK KOZDRÓJ

nich przylegając w postaci mikrokolonii lub zasiedlają

mieszczące się w nich mikropory, preferując te o śred-

nicy 2 µm. Łączna powierzchnia, jaką zajmują mikro-

organizmy, jest znikoma i stanowi jedynie od tysięcz-

nych do milionowych części procenta ogółu dostępnej

powierzchni, biorąc pod uwagę fakt, że powierzchnia

frakcji ilastej może zajmować do 10

w gramie gleby

[52]. Mikroagregaty, połączone egzopolisacharydami

produkowanymi przez drobnoustroje, a także strzęp-

kami grzybów, tworzą makroagregaty, wewnątrz i mię-

dzy którymi występują makropory o średnicy powy-

żej 6 µm. Środowiskiem wyraźnie stabilniejszym dla

mikroorganizmów pod względem: zasobności w wodę,

zawartości pokarmu, zaadsorbowanych makrocząste-

czek (białka, DNA) i toksycznych gazów (CO

, NO

a także zagrożenia ze strony drapieżnych pierwotnia-

ków, wazonkowców, skoczogonków lub roztoczy, są

mikroagregaty. Dlatego też strukturalna różnorod-

ność drobnoustrojów, czyli mozaika różnych popula-

cji składających się na daną społeczność, jest znacząco

odmienna w mikro i makroagregatach glebowych [51].

Przy badaniu tak złożonego środowiska pojawia się

problem, jaką strategię poboru próbek, jeżeli chodzi

o analizowany obszar, ich liczbę oraz wielkość, zasto-

sować, aby uzyskać reprezentatywny dostęp do jak

największej liczby mikroorganizmów występujących

w danej glebie. Niedocenianie tego problemu, zwłasz-

cza w przypadku stosowania metod molekularnych

w odniesieniu do bezpośrednich ekstraktów DNA/RNA,

może skutkować zafałszowanym obrazem strukturalnej

różnorodności i aktywności metabolicznej mikrobiomu.

Analizy mikrobiologiczne gleby muszą uwzględniać

zmienność bioróżnorodności w czasie [95] mierzonej

w skali wieloletniej, rocznej (efekt pór roku), dziennej

czy nawet godzinowej (pora dnia). Drugim faktem,

który należy uwzględniać, jest zmienność bioróżno-

rodności w przestrzeni w skali jednego pola lub więk-

szej (regionu, kontynentu), gdzie duże znaczenie mają

zmieniające się warunki edaficzne, głównie pH [5, 51,

70]. Ta zmienność implikuje dokonywanie losowego

poboru wielu próbek (5–10), na obszarze kilkudziesię-

ciu metrów kwadratowych danego pola (terenu), które

mogą być analizowane osobno lub razem po zmiesza-

niu. W tym ostatnim przypadku obserwuje się mniejszą

zmienność warunków fizycznych gleby oraz struktural-

nej różnorodności mikrobiomu [2]. Przy porównywa-

niu różnorodności mikroorganizmów, występujących

w różnych miejscach, musi być uwzględniony stopień

zmienności tej różnorodności w obrębie pojedynczego

miejsca, a więc bardzo ważna jest liczba wykonanych

powtórzeń [64]. Pojedyncze próbki, dające reprezenta-

tywny obraz mikrobiomu glebowego, mają minimalną

wielkość między 0,125 a 0,250 g [43, 65], jakkolwiek nie-

kiedy lepiej jest zastosować większe 10-g próbki zamiast

1-g lub 0,1-g, aby zmniejszyć stopień zmienności struk-

tury społeczności mikroorganizmów obserwowany mię-

dzy próbkami [57]. Znalezienie złotego środka w tym

przypadku opiera się na: rodzaju badanych populacji

mikroorganizmów – dominujące lub rzadkie (tu lepiej

zastosować większe próbki), a także samej glebie – efek-

tywność ekstrakcji DNA zmienia się w zależności od

typu gleby [51]. W mikroskali glebowej drobnoustroje

charakteryzują się wybitnie nierównomiernym roz-

mieszczeniem między makro i mikroagregatami [54].

Wiele rzadkich populacji może być przeoczonych, jeśli

badania nie będą prowadzone na poziomie tych agrega-

tów, z uwagi na maskujący efekt dominujących populacji

widoczny podczas analizy w makroskali tradycyjnych

próbek glebowych [43].

Wysoce heterogeniczny charakter gleby, pod wzglę-

dem struktury oraz rozmieszczenia mikroorganizmów,

stanowi olbrzymie utrudnienie dla efektywnej ekstrakcji

DNA lub RNA metagenomu glebowego. Zagadnienie

to zostało szerzej opisane we wcześniejszej pracy prze-

glądowej [45]. Najogólniej, kwasy nukleinowe ekstra-

huje się z gleby, stosując podejście bezpośrednie lub

pośrednie, kiedy DNA lub RNA izoluje się z wcześniej

wyodrębnionej frakcji komórkowej drobnoustrojów

glebowych. Otrzymany metagenomowy DNA oczywiś-

cie nie jest jednakowy pod względem ilościowym, i co

ważniejsze, jakościowym (czystość preparatu, stopień

pofragmentowania cząsteczki – a więc liczba i wielkość

fragmentów DNA). Bezpośrednia ekstrakcja daje od

10 do 100 razy więcej DNA, który może być bardziej

zanieczyszczony związkami humusowymi, zewnątrz-

komórkowym DNA oraz silniej pofragmentowany na

krótsze odcinki (0,5–20 kpz), niż w przypadku izo-

lacji DNA z frakcji komórkowej (10–50 kpz, a nawet

150–1000 kpz). Ta procedura jest jednakże najczęściej

stosowana w analizie metagenomu glebowego, cho-

ciaż rzadko można uzyskać więcej niż 60% ogólnej

puli DNA mikroorganizmów obecnych w danej glebie,

który jeszcze nawet w 30% może być tracony podczas

etapów oczyszczania [51]. Niekiedy korzystniejsze bywa

stosowanie procedury pośredniej ekstrakcji DNA, ale

i w tym przypadku należy liczyć się z tym, że trudno jest

uzyskać więcej niż 20–50% bakteryjnego DNA, z uwagi

na silną adsorpcję komórek do cząstek glebowych [67].

Szereg specyficznych przeszkód charakterystycznych

dla każdej ze strategii izolacji metagenomowego DNA

powoduje, że uzyskiwany obraz różnorodności mikro-

biomu glebowego jest mimo wszystko fragmentaryczny

i zależy w dużej mierze od rodzaju mikroorganizmów

i ich podatności na lizę, rozmieszczenia oraz stopnia

dostępności komórek i uwolnionego DNA w strukturze

gleby. W takiej sytuacji, pewnym rozwiązaniem, umożli-

wiającym uzyskanie w miarę wiarygodnego obrazu bio-

różnorodności, może być przeprowadzenie sukcesyw-

nego kilkakrotnego ekstrahowania DNA lub izolowania

komórek z tej samej próbki glebowej [23].

METAGENOM ŹRÓDŁO NOWEJ INFORMACJI O MIKROORGANIZMACH GLEBOWYCH

189

4. Analiza genetyczna mikrobiomu

Różnorodność mikroorganizmów w glebie może być

rozpatrywana pod kątem ogólnej oceny struktury mikro-

biomu i porównania między różnymi próbami, lub też

może dotyczyć dogłębnej identyfikacji składu społeczno-

ści drobnoustrojów zasiedlającej daną glebę. W związku

z tym należy zastosować różne strategie do sporządzania

próbek oraz ekstrakcji DNA, jak wyżej opisano. Co wię-

cej, odmienny charakter będzie też mieć analiza meta-

genomiczna w obu przypadkach. Jeśli celem jest pozna-

nie ogólnej struktury społeczności mikroorganizmów

i ewentualnych zachodzących w niej zmian, wystarcza-

jące jest wykorzystanie znanych metod „fingerprinto-

wych”, jak np. DGGE/TGGE czy T-RFLP [46]. Ponieważ

większość z tych metod opiera się na wcześniejszej ampli-

fikacji filogenetycznych markerów przez PCR, należy

być świadomym pewnych problemów specyficznych dla

reakcji PCR. Przykładem istotnego problemu jest prefe-

rencyjne amplifikowanie fragmentów genowych, pocho-

dzących od populacji będących w mniejszości, jeśli takie

fragmenty charakteryzują się ponad przeciętną efektyw-

nością przyłączania starterów i polimerazy DNA [91].

W konsekwencji otrzymane profile DNA nie będą rzetel-

nie odzwierciedlać składu analizowanego mikrobiomu.

Charakterystyczną cechą metod „fingerprintowych” jest

także to, że przedstawiony przez nie obraz mikrobiomu

obejmuje ograniczoną liczbę dominujących populacji. Te

populacje mogą być identyfikowane poprzez klonowanie,

a następnie sekwencjonowanie poszczególnych fragmen-

tów DNA pochodzących od różnych mikroorganizmów.

Nowa generacja metod „fingerprintowych” umożliwia

identyfikację bakterii i archeonów glebowych w oparciu

o mikromacierze genowe, które zawierają od 500 000 do

110 000 025-merowych sond oligonukleotydowych hybry-

dyzujących z metagenomowymi fragmentami genów

SSU rRNA po ich amplifikacji PCR, lub bezpośrednio

z rRNA, albo dwuniciowym komplementarnym DNA

(dscDNA). Daje to możliwość wykrycia od około 9 000

(PhyloChip G2) do ponad 50 000 (PhyloChip G3) OTU

(operational taxonomic unit) drobnoustrojów potencjal-

nie obecnych w metagenomie glebowym [1, 11, 17, 74].

Szczegółowe poznanie składu mikrobiomu glebo-

wego wymaga zastosowania innego podejścia anali-

tycznego w stosunku do wyekstrahowanego z gleby

metagenomowego DNA. Jednym ze sposobów, jed-

nocześnie najczęściej stosowanym, jest wykorzystanie

filogenetycznego markera w postaci genu SSU rRNA

(16S u prokariotów lub 18S u eukariotów), który po

amplifikacji PCR podlega klonowaniu celem otrzyma-

nia biblioteki reprezentującej wszystkie mikroorganizmy

obecne w badanej glebie. Następnie poszczególne sklo-

nowane fragmenty DNA są sekwencjonowane i pod-

dawane bioinformatycznej analizie. Drugim sposobem,

dzięki postępowi technologicznemu, jest analizowanie,

na podobnej zasadzie, losowych fragmentów DNA lub

całych metagenomów. W tym przypadku pofragmen-

towany materiał genetyczny jest swoistą mieszaniną

fragmentów DNA, w której szereg sekwencji nukle-

otydowych częściowo się pokrywa. W związku z tym,

po sekwencjonowaniu wystarczającej liczby małych

odcinków DNA istnieje możliwość odtworzenia dużych

fragmentów DNA, wystarczających do identyfikacji tak-

sonów, lub będących wręcz rekonstrukcją kompletnego

genomu [99]. Oczywiste jest, że w tej procedurze będą

wykrywane, w przeważającej mierze, najliczniej repre-

zentowane organizmy, dlatego tak ważne jest posługi-

wanie się większymi próbkami gleby w powtórzeniach,

co jest często trudne do spełnienia, aby wychwycić także

sekwencje DNA pochodzące od rzadkich taksonów.

Pewną pomocą jest przypadkowa natura sekwencjo-

nowania typu „shotgun”, która zapewnia, że wiele tych

organizmów jest reprezentowanych przynajmniej przez

jakieś małe fragmenty sekwencji nukleotydowych.

Niezależnie od strategii zastosowanej do analizy

metagenomu, w klasycznej postaci niezbędny etap klo-

nowania może dotyczyć małych lub dużych fragmentów

DNA, które też są wstawiane w różne wektory. Biblio-

teka małych wstawek dotyczy fragmentów DNA o wiel-

kości do 20 kpz wprowadzonych do plazmidów, nato-

miast duże fragmenty o wielkości do 40 kpz wstawiane

są do fosmidów lub kosmidów, a te o wielkości jeszcze

większej, przekraczającej nawet 100 kpz, znajdują się

w sztucznym chromosomie bakteryjnym BAC. Wspom-

niane wektory posiadają zalety i wady oraz różnią się

przeznaczeniem (Tab. I), a ich użycie zależy od: jakości

izolowanego glebowego DNA, wymagań odnośnie prze-

ciętnej wielkości wstawek w bibliotece, wymagań w sto-

sunku do liczby kopii wektora w komórce gospodarza,

rodzaju samego gospodarza, oraz strategii użytej do

przeszukiwania klonów [14]. Niemal wszystkie biblio-

teki klonów w początkowym etapie tworzenia, a także

w celu przechowywania sekwencji DNA metagenomu,

wykorzystują jako gospodarza bakterię

Escherichia coli.

W przypadku klonowania fragmentów DNA mikro-

organizmów glebowych, zwłaszcza w celu późniejszej

analizy funkcjonalnej genów, jako gospodarzy wybiera

się występujące w glebie bakterie z rodzaju

Pseudo-

monas

lub

Streptomyces

[12, 92]. Komórki

E. coli

czę-

sto nie mają odpowiedniej maszynerii transkrypcyjno

translacyjnej (np. efektywne promotory, czynniki sigma

czy białka regulatorowe), która umożliwiałaby ekspre-

sję genów lub operonów pochodzących od członków

mikrobiomu glebowego często różniących się znacz-

nie zawartością zasad G + C w genomie oraz systemem

wydzielniczym białek, co skutkuje nikłą ilością (niekiedy

mniej niż 0,01%) uzyskanych pozytywnych klonów

podczas jednej rundy przeszukiwania biblioteki [13,

30]. Konstruowane biblioteki metagenomu glebowego

są z reguły bardzo obszernymi kolekcjami fragmentów

Plik z chomika:

Petroc

Inne pliki z tego folderu:

wykład metagenomika.pdf (382 KB)
1.3.pdf (252 KB)
Sztuczne_zycie.pdf (4026 KB)
wykład 7.pdf (223 KB)
metagenom3.pdf (409 KB)

vol5222013185.pdf

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: