Zasady projektowania starterów:
1. PCR podstawowy i z enzymami restrykcyjnymi
a) Długość 17-25
b) startery podobnej długości
c) G+C = 40-60%
d) na 3’ końcu G lub C
e) Ta niższa o 2 - 50 C od Tm
2. PCR ze zdegenerowanymi primerami
a) najniższy poziom zdegenerowania
b) primery dłuższe niż 17 nt
c) poziom zdegenerowania poniżej 64
d) Inozynę stosujemy w celu zmniejszenia poziomu zdegenerowania
e) liczymy Tm maksymalną i minimalną
3. RACE
a) G+C = 50 - 70%
b) Ta > 720C
c) długość 23 - 28 nukleotydów
d) na 3’ końcu tylko 2 G/C z 5 ostatnich nukleotydów
e) uważać na wzajemną komplementarność
4. Real - time PCR
a) tworzony amplikon o długości 75 - 200 pz
b) G+C = 50 - 60%
c) Tm w zakresie 50 - 600C
d) unikać struktur drugorzędowych (uważać na komplementarność)
e) unikaj powtórzeń G/C dłuższych niż 3
f) G/C na końcach primerów
g) długość starterów 18 - 25 nt
5. Mutageneza ukierunkowana
a) oba startery muszą zawierać żądaną mutację i być do siebie komplementarne
b) długość 25 - 45 zasad
c) Tm > 780C
d) Temperaturę się inaczej liczy!!
Zamiana zasad: Tm=81,5+0,41(%GC)-[675/N]-% zmienionych zasad
N – długość startera wyrażona w liczbach całkowitych, tak samo dla %GC
Insercja lub delecja: Tm=81,5+0,41(%GC)-[675/N]
N – nie zawiera zasad dodawanych lub usuwanych, %GC również nie zawiera nukleotydów dodawanych jak i odejmowanych. Obie wartości wyrażone są w liczbach całkowitych
e) 10 - 15 komplementarnych zasad po obu stronach mutacji
f) G+C powyżej 40%
g) startery dodatkowo oczyszczone
h) startery dodawane w nadmiarze
i) na obu końcach jedną lub kilka zasad G/C
6. Mutageneza przypadkowa
a) długość 18 - 25 nt
b) G+C = 40 - 60 %
c) oba końce zaczynają się od G/C
d) Tm w przedziale 55 - 720C
e) G/C nie powinny występować w powyżej 3 powtórzeniach z rzędu
Petroc