Wykład 1
Enzymy są wytwarzanymi przez inne organizmy katalizatorami przemian chemicznych, stąd nazwa biokatalizatory. W warunkach panujących w komórkach reakcje metaboliczne mogą przebiegać jedynie w ich obecności.
W miarę rozwiju badań w zakresie struktury i funkcji enzymów kształtowała się enzymologia praktyczna w tym:
- diagnostyka i
- enzymologia przemysłowa pozwalająca na świadome i kontrolowane stosowanie enzymów do przeprowadzenia procesów chemicznych w dużej skali.
Dziś enzymologia decyduje o postępie w wielu dziedzinach nauk przyrodniczych i w wielu gałęziach przemysłu.
Działanie wszelkiego rodzaju katalizatorów, a więc i enzymów polega na zmniejszeniu energii aktywacji reagujących związków.
Energia aktywacji jest to najmniejsza ilość energii, którą trzeba dostarczyć 1M substratów aby każda z cząsteczek stała się reaktywna.
Reagują bowiem tylko te cząsteczki które znajdują się na odpowiednio wysokim poziomie energetycznym, czyli te które są w stanie aktywnym.
Różnica pomiędzy podstawowym poziomem energetycznym a poziomem odpowiadającym stanowi aktywacji [GA] zwana jest barierą energetyczną.
Po jej pokonaniu następuje reakcja, w czasie której wydziela się energia bedąca różnicą stanów energetycznych substratu i produktu. Rys 1.2.
Obniżenie bariery energetycznej obrazują następujące przykłady:
EA hydrolizy sacharozy – 109,0 kJ/mol [kwasowa], 46,1 kJ/mol [β-fruktofuranozydaza];
EA rozkłądu H2O2 – 75kJ/mol [spontaniczny], 50kJ/mol [platyny], 8,44kJ/mol [katalaza].
Wszystkie enzymy są białkami a ich funkcjonalność jest bezpośtednią konsekwencją sekwencji aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym nazwanej strukturą I-rzędową.
Wpływa ona bowiem na konformację białka, czyli strukturę przestrzenną.
Od niej zależy jaki jest udział w stabilizowanej wiązaniami wodorowymi strukturze II-rzędowej
- formu α-heliksu
- β-harmonijki i
- struktur nieorganicznych
- a wreszcie jakie są mozliwości tworzenia się, w wyniku interakcji pomiedzy bocznymi grupami reszt aminokwasowych
- wiązań elektrostatycznych,
- wodorowych i
- kowalencyjnych disiarczkowych oraz
- oddziaływań hydrofobowych
Kształtujących strukturę III-rzędową.
Końcową konsekwencją jest możliwość łączenia się tak ukształtowanych łańcuchów polipeptydowych białka (podjednostki) poprzez
- oddziaływania hydrofobowe i
- wiązania niekowalencyjne
pomiędzy sobą (struktura IV-rzędowa), a także z błonami i innymi strukturami subkomórkowymi.
Sekwencja łańcuchów polipeptydowych decyduje więc o
- różniach strukturalnych, a więc
- o wielkości cząstek białka enzymatycznego.
Względna masa cząsteczkowa enzymów zawiera się w granicach od 13 000 do kilku milionów, przy czym dla większości enzymów od 30 000 do 50 000.
Wielkość cząstki wiaże się w dużym stopniu z funkcjonalnością enzymów.
- enzymy pozakomórkowe charakteryzują się generalnie niższą względną masą cząsteczkową [co ułatwi ich transfer] i często zawierają mostki disiarczkowe stabilizujące ich strukturę w środowisku pozakomórkowym.
- enzymy regulacyjne mają na ogół wyższą względną masę cząsteczkową i często składaja się z podjednostek, co ułatwia metaboliczną kontrolę w srodowisku wewnetrznym (lub zewnętrznym – nie mogę rozczytać bo pierwsze 2 literki są zasłonięte J )
Duże różnice występują także pomiędzy enzymami posiadającymi jednakowe centrum aktywne.
Stwierdzono, że długość łańcucha polipeptydowego proteinaz serynowych wynosi od 185-800 reszt aminokwasowych.
Na podstawie różnic strukturalnych możemy podzielić enzymy na monomeryczne, oligomeryczne i występujące w kompleksach enzymowych.
KLASYFIKACJA ENZYMÓW UWZGLĘDNIAJĄCA RÓŻNICE STRUKTURALNE :
· MONOMERYCZNE
- Lizosym
- Elastaza
- Trypsyna
- Chymotrypsyna
· OLIGOMERYCZNE
- zbudowane z identycznych podjednostek
- zbudowane z nieidentycznych podjednostek
· KOMPLEKSY WIELOENZYMOWE
W formie
- rozpuszczalnej
- związanej z błonami
- związanej ze strukturamu subkomórkowymi
Od lat siedemdziesiątych 20 wieku jako monomery traktuje się też enzymy zbudowane z dwu lub więcej łańcuchów połączonych wiązaniami disiarczkowymi np. chymotrypsyna.
Enzym ten w formie aktywnej składa się z trzech odrębnych łąńcuchów polipeptydowych połączonych mostkami disiarczkowymi w pozycjach 1-122 oraz 136-201.
Taka forma aktywna powstaje z nieaktywnego łańcucha proenzymu – chymotrupsynogenu, w wyniku hydrolizy 4 wiązań peptydowych i uwolnienia 2 dipeptydów.
Enzymy oligomeryczne zbudowane są z dwu lub więcej podjednostek połączonych niekowalencyjnie wiązaniami lub oddziaływaniami. Podjednostki te wiążą się ściśle określonymi zawsze tymi samymi obszarami kontaktowymi tworząc ściśle okteślony symetryczny układ przestrzenny.
Jego strukturę [IV-rzędową] określa ułożenie przestrzenne podjednostek [protomerów] oraz zespół ich kontaktów oraz oddziaływań wzajemnych.
Protomery mogą być zbudowane z jednego lub kilku łańcuchów polipeptydowych.
W łączeniu podjednostek i stabilizacji oligomerów oddziaływania hydrofobowe odgrywają większą rolę od wodorowych i jonowych.
Szczególną tendencję do asocjacji wykazują protomery zawierajace >30% aminokwasów hydrofobowych. Wynika to z faktu, że nie wszystkie reszty hydrofobowe mogą być upakowane wewnątrz cząsteczek, część z nich występuje na powierzchni.
Enzymy oligomeryczne mogą być zbudowane z:
- identycznych podjednostek współdziałąjących ze sobą w czasie katalizy. Zmiana konformacji jednej z podjednostek wywołana przyłączeniem pierwszej cząsteczki substatu indukuje zmianę konformacji pozostałych protomerów.
- z nieidentycznych podjednostek wśród których można wyróżnić katalityczne i regulatorowe.
Zmiana konformacji podjednostki regulatorowej wywołąna związaniem efektora allosterycznego powoduje zmiany strukturalne podjednostki zawierającej centrum aktywne.
Przykładem enzymu oligomerycznego jest karbamoilotransferaza asparaginianowa, katalizująca przeniesienie karbamoilofosforanu na kwas asparaginowy (powstaje kwas karbamoiloasparaginowy – prekursor CTP i UTP).
Enzym składa się z 6 podjednostek katalitycznych i 6 regulatorowych.
Część enzymów oligomerycznych to enzymy wielofunkcyjne. Pojawienie się określonych funkcji katalitycznych może zależeć od stopnia asocjacji podjednostek. Np. dehydrogenaza aldehydu 3P-glicerynowego jako tetramer wykazuje aktywność dehydrogenazy i niewielką aktywność esterazową, a jako dimer aktywność esterazową.
Heksokinaza katalizująca reakcję fosforylacji glukozy przez ATP (96000,4 łańcuchy) dimeryzuje w obecności Glu 6P i w tej postaci nie wykazuje aktywności.
Powstanie i dysocjacja dimeru heksokinazy:
Łatwość dysocjacji i asocjacji enzymów oligomerycznych, w przypadkach gdzie występuje więcej niż jeden typ enzymu o tym samym działaniu, może prowadzić do powstawainia form hybrydowych, co może być przyczyną występowania większej liczby izoenzymów.
Kompleksy wieloenzymowe
Enzymy w nich występujące katalizują sprzężone ze sobą reakcje chemiczne. Działąją w sposób bardzo ekonomiczny: reakcje mogą przebiegać przy niższym stężeniu substratu, zapewniona jest:
- maksymalna szybkość reaktywacji koenzymów i
- regulacja procesu.
Asocjacja enzymów tworzących kompleks ma charakter bardzo swoisty podobnie jak podjednostek w oligomerach.
Kompleksy te cechuje jednak
- regularna i zwarta budowa geometryczna oraz
- duża trwałość.
Oddzielone enzymy stają się nieaktywne.
Przykłady:
Kompleks dehydrogenazy pirogronianowej przeprowadza oksydacyjną dekarboksylację kwasu pirogronowego do acylo-CoA
Kompleks syntetazy kwasów tłuszczowych.
Układ enzymatyczny, który katalizuje syntezę długołańcuchowych nasyconych kwasów tłuszczowych z:
- acylo-CoA
- malonylo-CoA oraz
-NADPH
nazywamy syntetazą kwasów tłuszczowych.
Syntetaza (drożdży) stanowi kompleks wieloenzymatyczny. Kompleks zbudowany jest z dwóch rodziajów łańcuchów polipeptydowych, ma skład podjednostek α6β6
Łańcuch α – zawiera:
- białkowy nośnik grup acylowych
- enzym kondensujący oraz
- reduktazę β-ketoacylową
Łańcuch β – zawiera:
- transferazę acetylową
- transferazę molonylową
- dehydratazę β-ketoacylowa oraz
- reduktazę enoilową.
Najważniejszy stopień organizacji przejawiają kompleksy lub układy enzymatyczne zasocjowane z dużymi strukturami supramolekularnymi, takimi jak błony lub rybosomy np. łańcuch enzymów oddechowych przenoszących elektrony z substratów na tlen.
Spośród kilkuset aminokwasów tworzących łańcuch polipeptydowy białka enzymatycznego (apoenzym) jedynie kilka reszt (aminowkasy kontaktowe) jest zaangażowanych bezpośrednio w wiązanie substratu i katalizę. Te reszty poprzez ich wirtualny potencjał jonizacji i polarność determinują specyficzność i mechanizm reakcji charakterystycznych dla poszczególnych enzymów.
Natura reakcji katalizowanej przez dany enzym zależy więc od aminokwasów które stanowią centrum aktywne nazywane również centrum katalitycznym. Obecnie w obszarze centrum aktywnego wyróżnia się:
- miejsce wiązania substratu
- miejsce katalityczne
Miejsce wiazania substratu jest to miejsce określające swoistość enzymu, która dotyczy niezwykłej wybiurczości w stosunku do substratów.
Wybiurczość substratowa polega na tym, że:
- enzym szczególnie aktywnie katalizuje przemianę związku zawierającego oprócz grupy reagującej również inne grupy funkcyjne, a brak tych grup albo zablokowanie ogranicza ewentualnie eliminuje działanie enzymu lub
- enzym działa tylko na jeden z izomerów optycznych danego związku ( stereoswoistość) lub
- enzym jest szczególnie aktywny wobec związków o określonej długości łańcucha węglowego.
W specyficzności substratowej znacząca rolę wydaje się odgrywać plastyczność struktury łańcucha polipeptydwego enzymu. Struktura, kształt i topografia zwiniętego łąńcucha może decydowac nie tylko o wiązaniu substratu na jego powierzchni, może także ułatwiać dyfuzję substratu do miejsca transformacji.
Miejsce katalityczne jest to obszar, w którym zachodzi reakcja. Struktura tego miejsca decyduje o swoistości enzymu względem katalizowanej reakcji, czyli swoistości działania, która polega na tym, że dany enzym katalizuje tylko jedną z reakcji chemicznych, w których może brać udział przyłączony substrat.
Możemy wyróżnić także:
- miejsca wiązania koenzymu z apoenzymem oraz
- reszty aminokwasów pomocniczych, które służą właściwej przestrzennej orientacji pomiędzy centrum aktywnym enzymu a substratem oraz kofaktorami, w tym koenzymami niezbędnymi do przebiegu reakcji.
Zdolność struktury przestrzennej enzymu do przekształceń i jego interakcje z otaczającym mikrośrodowiskiem są także odpowiedzialne za kontrolę i regulację aktywności enzymatycznej.
Wiąże się z tym pojęcie centrum allosteryczne enzymu – jest to obszar leżący poza centrum aktywnym do którego mogą przyłączać się aktywatory lub inhibitory zwane efektorami allosterycznymi (są to drobnocząsteczkowe związki, które po przyłączeniu do enzymu nie ulegają żadnym przemianom chemicznym).
Związanie efektora allosterycznego wywołuje zmiany konformacji enzymu. Regulacja taka dotyczy najczęściej, choć nie wyłącznie enzymów oligomerycznych i w konsekwencji prowadzi do zmian w strukturze IV-rzędowej.
Wiele enzymów zawiera w cząsteczce koenzym, czyli drobnocząsteczkowy związek organiczny lub jony nieorganiczne, których obecność w centrum aktywnym jest niezbędna do katalitycznego działania enzymu.
Obecnie określenie koenzym stosuje się zarówno do grup prostetycznych (silnie związane z apoenzymem), jak i do substratów pośredniczących (łatwo dających się usunąć z części białkowej w czasie preparatyki).
Określony koenzym współdziała w akcie katalitycznym z jednym okteślonym apoenzymem jako holoenzym.
Są także koenzymy, które sprzęgają 2 reakcje katalityczne współdziałając z 2 enzymami. Określa się je jako pośredniczące lub przenoszące substraty.
Przykładem może być NAD sprzęgający enzymatyczne reakcje utleniania i redukcji, np.:
- działając z dehydrogenazą alkoholową poełni funkcję akceptora wodorów,
- w formie zredukowanej odłącza się od tego apoenzymu i bierze udział w następnej reakcji gdzie działa jako donor wodorów tworząc holoenzym z drugim enzymem np. reduktazą cystynową.
Taki sam koenzym może wchodzić w skład różnych holoenzymów katalizujących różne reakcje chemiczne, np. fosforan pirydoksalu jest koenzymem aminotransferaz i niektórych dekarboksylaz aminokwasów.
Przyłączenie koenzymu do apoenzymu wpływa na ukształtowanie się konformacji optymalnej dla przebiegu reakcji enzymatycznej.
Natomiast jego dysocjacja obok
- oczywistej utraty aktywności enzymatycznej
- może wywołać znaczące zmiany strukturalne.
Charakter reakcji chemicznej katalizowanej przez enzym jest podstawą międzynarodowych nazw enzymów.
Do codziennego użytku wygodniejsze są krótsze nazwy zwyczajowe pod warunkiem, że określają w sposób jednoznaczny działanie enzymu i jego substrat.
Zgodnie z zaleceniami Komisji Enzymowej, po nazwie zwyczajowej należy podawać czterocyfrowy symbol klasyfikacyjny enzymu np.
dehydrogenaza alkoholowa EC 1.1.1.1 (enzym ten nosi nazwę systematyczną oksydoreduktaza alkohol: NAD i katalizuje reakcję):
Alkohol + NAD = aldehyd lub keton + NADH + H+
Pierwsza cyfra wskazuje na przynależność enzymu do jednej z głównych 6 klas. Są to:
1. Oksydoreduktazy – reakcje oksydoredukcyjne
2. Transferazy – przenoszenie określonych grup pomiędzy związkami
3. Hydrolazy – rozkład różnych wiązań z udziałem cząsteczki wody
4. Liazy – odłączenie różnych grup od substratu bez udziału wody
5. Izomerazy – reakcje izomeryzacji
6. Ligazy [syntetazy] – wytwarzanie wiązań pomiędzy atomami w cząsteczkach substratów.
Druga cyfra dotyczy podziału na podklasy określające:
W klasie 1 i 2 – rodzaj grupy, której dotyczy reakcja,
W klasie 3, 4, 6 – typ wiazania rozrywanego lub tworzonego,
W klasie 5 – rodzaj izomeryzacji.
Trzecia cyfra wskazuje przynależność do odpowiedniej pod-podklasy grupującej enzymy:
- działające na określone grupy substratów lub
- działające w obecniści określonych akceptorów
- a w przypadku enzymów proteolitycznych – posiadające specyficzne centrum aktywne.
Czwarta cyfra jest numerem porządkowym enzymu w danej pod-podklasie.
Kowalencyjne modyfikacje enzymów
Modyfikacje kowalencyjne jak sama nazwa wskazuje dotyczą:
- rozerwania istniejących wiązań kowalencyjnych w cząsteczce enzymu
- utworzenia nowych wiązań kowalencyjnych w cząsteczce enzymu. Przy czym nowe wiązania mogą być utworzone:
∙ w specyficznych warunkach pomiędzy grupami funkcyjnymi aminokwasów występujących w łańcuchach polipeptydowych enzymu (wiązania wewnątrzcząsteczkowe i międzyczasteczkowe)
∙ w wyniku reakcji grup funkcyjnych z innymi związkami chemicznymi wprowadzonymi celowo lub znajdujacymi się w środowisku.
· Do pierwszej grupy możemy zaliczyć hydrolizę wiązań peptydowych. Ma ona miejsce podczas przekształcania proenzymów w formę aktywną. Przykładem są proenzymy (zymogeny) trawiennych enzymów proteolitycznych takie jak np. trypsynogen, pepsynogen, chymotrypsynogen, których uaktywnienie wymaga „wycyęcia” z cząsteczki określonych peptydów, a więc hydrolizy enzymatycznej specyficznych wiązań peptydowych. Proces aktywacji chymotrypsynogenu polega na hydrolizie 4 wiązań peptydowych i uwolnieniu 2 peptydów.
Cecha charakterystyczną tych modyfikacji struktury I-rzędowej są takie zmiany konformacji, które prowadzą do utworzenia miejsc wiażących substrat i optycznego ukształtowania miejsca katalitycznego.
Do tej grupy zaliczyć należy także niecelowe modyfikacje z którymi możemy mieć doczynienia podczas oczyszczania i izolowania enzymów. Są one związane z obecnością, szczególnie w początkowych etapach tych procesów, enzymów proteolitycznych w materiale biologicznym. Generalnie uszkodzenie struktury I-rzędowej, a w szczególności fragmentów odpowiedzialnych za działanie katalityczne powoduje inaktywancję enzymu.
Tylko niektóre enzymy i to o stosuknowo prostej budowie, nie tracą aktywności nawet wtedy gdy znaczna część reszt aminokwasów (poza centrum aktywnym) zostaje pod wpływem proteinaz usunięta z ich cząsteczek.
- odłączenie 3 aminokwasów od C-końca rybonukleazy nie zmienia jej aktywnosci nukleolitycznej
- z cząsteczek papainy (185 reszt) można usunąć proteolitycznie 109 reszt aminokwasów, a pozostała cząstka wykazuje pełną aktywność.
· Do pierwszej grupy należą także modyfikacje polegajace na redukcji wiązań disulfidowych w cząsteczce enzymu. Problem należy rozpatrywać w dwóch aspektach.
÷ jeżeli obecność grup –SH jest niezbedna do aktywności enzymu (np. enzymy zawierające grupy –SH w centrum aktywnym, takie jak papaina, dehydrogenazy : 3P gliceraldehydowa czy alkoholowa, karboksylaza pirogronianowa) modyfikacja polegająca na modyfikacji mostków disulfidowych jest celowa. Reduktory traktujemy wówczas jako aktywatory enzymu. Stosujemy do tego celu związki o niskim potencjale oksydoredukcyjnym, zawierajace grupy –SH, takie jak cysteina, glutation, merkaptoetanol.
÷ drugi aspekt to modyfikacje niecelowe, gdzie pod wpływem obecnych w środowisku czynników redukujacych mogą ulegać rozerwaniu mostki disulfidowe decydujące o optymalnej dla katalizy konformacji enzymu.
· Do drugiej grupy modyfikacji (dotyczących tworzenia nowych wiązań pomiedzy grupami bocznymi aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym enzymu) zaliczmy:
- tworzenie wiązań disulfidowych pomiędzy grupami –SH pod wpływem łagodnych czynnik...
beeola