Ilościowe oznaczanie białek.pdf

(63 KB) Pobierz
Ilościowe oznaczanie białek
Zagadnienia do opracowania:
1. Stężenia roztworów: procentowe, molowe, przeliczanie stężeń
2. Siła jonowa buforów, pH
3. Prawo Lamberta-Beera, molowy współczynnik ekstynkcji (ε) własności spektralne
aminokwasów aromatycznych
4. Podstawowe informacje na temat budowy i właściwości aminokwasów i białek:
właściwości aminokwasów, struktury rzędowe białek, podział i funkcje białek,
właściwości BSA
5. Metody ilościowego oznaczania białka (informacje załączone w instrukcji)
Oznaczanie ilościowe białek ma na celu określenie stężenia badanego białka w
próbce. Istnieje wiele metod ilościowego oznaczania białek i peptydów. Najczęściej
używane metody kalorymetrycznego oznaczania zawartości białka w roztworze to:
- pomiar absorbancji w nadfiolecie
- metoda Lowry’ego
- metoda Bradforda
- metoda BCA
Każda z tych metoda ma zalety jak również pewne ograniczenia. Celem ćwiczenia jest
zapoznanie się z każdą z tych metod jak również nabycie umiejętności dostosowania
wybranej metody ilościowego oznaczania białek w zależności od pochodzenia i
zawartości badanej próbki.
1. Pomiar absorbancji w nadfiolecie
Większość białek dzięki obecności tyrozyny i tryptofanu wykazuje maksimum
absorbancji przy 280 nm. Inny aminokwasy aromatyczny – fenyloalanina ma
maksimum absorbancji przy 260nm. Pomiar absorbancji jest możliwy dzięki użyciu
spektrofotometru.
Wykonanie ćwiczenia:
Materiały:
1. Roztwór 1mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA)
2. Roztwór białka o nieznanym stężeniu
Wykonanie:
1. Ustawić spektrofotometr na 280 nm
2. Wyzerować spektrofotometr kuwetą z wodą
3. Zmierzyć absorbancję badanej próbki przy 280 nm
4. Ustawić spektrofotometr na 269 nm
5. Wyzerować spektrofotometr kuwetą z wodą
6. Zmierzyć absorbancję badanej próbki przy 260 nm
Opracowanie wyników:
Stężenie białka w mg/ml oblicza się ze wzoru:
C białka = 1.55 x A(280nm) – 0.76 x A (260nm)
2. Metoda Lowry’ego
Metoda Lowry’ego oznaczania białka wykorzystuje czułą reakcję, która jest
mieszaniną dwóch reakcji:
1) reakcja
aminokwasów
z
odczynnikiem
Folina-Ciocalteu
(kwas
fosforomolibdenowy). Reakcji ulega tyrozyna, tryptofan, cysteina i
prawdopodobnie histydyna występujące w białkach. Grupy boczne tych
aminokwasów są zdolne do redukcji jonów Mo
6+
/W
6+
występujących w
odczynniku Folina-Ciocalteu do niższych tlenków
2) reakcja pomiędzy wiązaniem peptydowym a jonami Cu
2+
w środowisku
alkalicznym (reakcja biuretowa). Jony miedzi ponadto biorą udział również w
procesie redukcji odczynnika Folina, przez co zwiększa się czułość reakcji
Absorbancję powstałego barwnego (niebieskiego) produktu reakcji odczytuje się przy
750nm.
Redukcja kwasu fosforomolibdenowego do tlenków molibdenowych zachodzi szybko
w środowisku o pH ok.10. Jednak przy tym pH kwas fosforomolibdenowy jest
nietrwały i łatwo ulega hydrolizie do kwasu ortofosforowego (V) i molibdenowego.
Aby temu zapobiec, należy po dodaniu odczynnika Folina-Ciocalteu natychmiast
zmieszać badaną próbę.
Wykonanie ćwiczenia:
Materiały:
1. Roztwór 1mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA)
2. Odczynnik Folina-Ciocalteu: Na2WO4xH2O + Na2MoO4xH2O + H3PO4+HCl
3. Roztwór białka o nieznanym stężeniu
Wykonanie:
1. Z wyjściowego roztworu 1 mg/ml BSA przygotować serię rozcieńczeń do
wykonania krzywej kalibracyjnej, o stężeniach: 1 ug/ml, 25 ug/ml, 50 ug/ml,
75 ug/ml, 100 ug/ml.
2. 500ul każdego roztworu rozcieńczonego białka pobrać do dużej kuwety.
3. Do każdej kuwety dodać 2,5 ml przygotowanego bezpośrednio przed
pomiarem odczynnika Lowry’ego (16,7 ml odczynnika A zmieszać z 167 ul
odczynnika B) Odczekać 10 minut.
4. Do każdej kuwety dodać 250 ul odczynnika Folina-Ciocalteu. Odczekać 10
minut.
5. Wykonać pomiar absorbancji przy 750 nm i wykreślić krzywą wzorcową.
6. Wykonać pomiar absorbancji nieznanej próbki. W razie potrzeby próbkę
rozcieńczyć. Z krzywej wzorcowej odczytać stężenie badanej próbki.
3. Metoda Bradforda
W metodzie tej wykorzystuje się zdolność wiązania barwnika Coomassie Brillant Blue
G-250 (CBB-G250) z grupami aminowymi białek za pomocą wiązań jonowych i
hydrofobowych. Z barwnikiem głównie reagują reszty Arg; w minimalnym stopniu
reszty His, Lys, Tyr, Trp i Phe. CBB w środowisku kwaśnym ma brunatne zabarwienie,
które po reakcji z białkiem zmienia się na błękitne. Wiąże się z tym zmiana
maksimum pochłaniania z 465 na
595 nm.
Natężenie barwy jest proporcjonalne do
zawartości białka w roztworze.
Uwagi:
Barwnik CBB ma tendencję do przylegania do ścian kuwety- najlepiej używać kuwet
polistyrenowych. Między oznaczeniami płukać metanolem, po ćwiczeniach umyć
kuwety zanurzając je na kilka godzin w 0,1M HCl.
Wykonanie ćwiczenia:
Materiały:
1. Roztwór 1mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA)
2. Odczynnik Bradforda
3. Roztwór białka o nieznanym stężeniu
Wykonanie:
1. Z wyjściowego roztworu 1 mg/ml BSA przygotować serię rozcieńczeń do
wykonania krzywej kalibracyjnej, o stężeniach: 1 ug/ml, 2.5 ug/ml, 5 ug/ml,
7.5 ug/ml, 10 ug/ml.
2. 700ul każdego roztworu rozcieńczonego białka pobrać do małej kuwety.
3. Do każdej kuwety dodać 700 ul odczynnika Bradforda. Odczekać 5 minut.
4. Wykonać pomiar absorbancji przy 595 nm i wykreślić krzywą wzorcową.
5. Wykonać pomiar absorbancji nieznanej próbki. W razie potrzeby próbkę
rozcieńczyć. Z krzywej wzorcowej odczytać stężenie badanej próbki.
4. Metoda BCA (metoda z kwasem bis-cynchoninowym)
Jest to modyfikacja metoda biuretowej oznaczania białka. W środowisku alkalicznym
składniki białek takie jak tyrozyna, tryptofan, cysteina, cystyna redukują jony Cu2+ do
jonów Cu1+, które z kolei tworzą barwny kompleks z kwasem bis-cynchinonowym
(BCA). Absorbancję barwnego kompleksu odczytuje się przy długości fail
562 nm.
Wykonanie ćwiczenia:
Materiały:
1. Roztwór 1mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA)
2. Roztwór kwasu bis-cynchinonowego (BCA)
3. Roztwór białka o nieznanym stężeniu
Wykonanie:
1. Z wyjściowego roztworu 1 mg/ml BSA przygotować serię rozcieńczeń do
wykonania krzywej kalibracyjnej, o stężeniach: 1 ug/ml, 25 ug/ml, 50 ug/ml,
75 ug/ml, 100 ug/ml.
2. 50ul każdego roztworu rozcieńczonego białka pobrać do małej kuwety.
3. Do każdej kuwety dodać 1 ml odczynnika BCA. Kuwety inkubować 15 minut w
60
0
C
4. Wykonać pomiar absorbancji przy 562 nm i wykreślić krzywą wzorcową.
5. Wykonać pomiar absorbancji nieznanej próbki. W razie potrzeby próbkę
rozcieńczyć. Z krzywej wzorcowej odczytać stężenie badanej próbki (w
przypadku rozcieńczenia próbki – rozcieńczenie należy uwzględnić w
określeniu stężenia próbki)

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika:

Zgłoś jeśli naruszono regulamin